Диссертация (1141398), страница 6
Текст из файла (страница 6)
K. Frederiksson и др. [114] исследовалистабильность БХНМ в 0,01 М цитратном буфере со значением pH от 2,78 до 7,34.По данным их исследования максимальная стабильность действующего веществанаблюдается в области значений pH 3,4 – 4,8. В других источниках указано, чтодеградация минимальна при pH 5,2 – 5,5 и резко возрастает при значении pHбольше 6 [129, 130]. При изучении стабильности тауромустина и ломустина вразличных средах и буферах наблюдали увеличение скорости деградациипрепаратов при pH больше 4.
Увеличение скорости гидролиза наблюдалась восновном в средах, содержащих бикарбонат натрия, а присутствие аминокислот,витаминов, неорганических солей и фосфатного буфера практически неоказывало влияние на стабильность [132, 133, 152]. При возрастании pH растворализомустина с 3 до 7 наблюдалось возрастание скорости гидролиза в 10 раз [56].33Кроме значения рН среды, основным дестабилизирующим факторомявляются: температура, освещенность, растворители, нуклеофилы, ионы тяжелыхметаллов (стекло первичной упаковки) [8, 112, 118].
Так, у БХНМ температураплавления находится в интервале 29–31оС. При нагревании на водяной бане дотемпературы 50–60 оС наблюдалось снижение содержания АФИ в растворелизомустина. В десятки раз наблюдалось возрастания скорости расщеплениялизомустина при облучении светом и УФ [21].Выше приведенные данные указывают на необходимость введения в составЛФ данной группы ЛС кроме веществ, повышающих растворимость, различныхстабилизаторов.ВИсландиипроводилиисследованияпоувеличениюстабильности ломустина и тауромустина путем добавления циклодекстринов.Комплекс ломустина с 2-гидроксипропил-β-циклодекстрином гидролизуется в 2–2,5 раза медленней, чем обычная форма ломустина, а скорость гидролизакомплекса тауромустина с гидроксипропил-α-циклодекстрином меньше в 1,25–1,5раза, по сравнению с раствором без циклодекстрина [132, 133].Для уменьшения скорости деградации в несколько раз и поддержанияоптимального pH в состав ЛФ аранозы и лизомустина вводили соответственносорбиновую и лимонную кислоты [95].Ещё одним методом, применяемым для стабилизации производных АНМ,является сублимационное высушивание.
В ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н.Блохина» разработали режимы для сублимационного высушивания рядапрепаратов на основе АНМ (араноза, лизомустин, БХНМ), получаемыелиофилизаты легко гидратировались, были стабильны и фармакологическиактивны в течение всего установленного срока годности [39].1.6. Структура и противоопухолевая активность субстанции ормустинаВ структуре ормустина цитотоксическая группа присоединена к боковойцепиаминокислотыL-орнитин,аα-амино-икарбоксильнаягруппы,определяющие основные биохимический свойства аминокислот, в том числе ихтранспорт через клеточные мембраны, сохранены.34Ормустин представляет собой смесь двух изомеров (рис.
8) по положениюнитрозо-группы.Рисунок 8 – Структурная формула ормустинаЦитотоксическую активность субстанции ормустина in vitro изучали наклеточных линиях диссеминированной меланомы человека Mel Kor и Тлимфобластного лейкоза человека Jurkat.8ИК50×10-4 М7654Mel Kor3Jurkat210244872Время инкубации, чРисунок 9 – Цитотоксическая активность АФИ ормустина на клеточныхлиниях диссеминированной меланомы человека Mel Kor и Т-лимфобластноголейкоза человека JurkatПо данным графика, представленного на рисунке 9, видно, что АФИормустина обладает высокой цитотоксической активностью, при увеличении35времени инкубации уменьшается показатель ИК50 – с 8×10-4 до 5×10-4 М для MelKor и с 7×10-4 до 3×10-4 М для Jurkat.Противоопухолеваяактивностьсубстанцииизучаласьinvivoприоднократном внутрибрюшинном введении на трех опухолевых штаммах:эпидермоидной карциноме лёгкого Льюиса, меланоме B-16 и лимфолейкозе P388.Исследования проводили на мышах линий DBA/2, C57BL/6 и гибридовBDF1(C57Bl/6×DBA/2), массой 22–27 г.
Ормустин in vivo не только значительноувеличивал (на 26–238%) продолжительность жизни мышей с лимфолейкозом P388, но и вызывал их излечение. При лечении животных с солидными опухолями(карцинома лёгкого Льюиса и меланома B-16) ормустин дозозависимозначительно ингибировал рост первичного опухолевого узла, увеличиваллатентныйпериодпоявленияопухолейпродолжительность жизни животных [7].умышейиувеличивал36Заключение по главе 1Разработка оригинальных противораковых ЛП является одним из основныхнаправленийразвитиясовременнойфармацевтическойнауки.Широкоеприменение в противоопухолевой терапии нашли алкилирующие агенты. Однимиз классов данной группы являются производные АНМ.
Они обладают широкимспектром противоопухолевого действия, в особенности в комбинации с другимипрепаратами и, в ряде случаев, превосходят по эффективности другие группы. ВИнституте органического синтеза им. Постовского синтезировано соединениеданного класса – ормустин. Результаты проведения биологических исследованийпротивоопухолевой активности субстанции ормустина в опытах in vivo и in vitroдали основание для разработки инъекционной ЛФ.Создание стабильной ЛФ – это многофазный процесс, который начинается сизучения свойств АФИ. Так как парентеральный путь введения обладает рядомпреимуществ, в том числе быстрой скоростью наступления терапевтическогоэффекта, для препаратов из группы АНМ, которые легко гидролизуются,применение этого метода введения является предпочтительнее.37ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1.
Материалы, реактивы и оборудованиеДействующее вещество:Ормустин – NƐ-нитрозо-NƐ-[N'-(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин иNƐ-[N'-(2-хлорэтил)-N'-нитрозокарбамоил]-L-орнитин (Институт органическогосинтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН, Екатеринбург).Ормустин представляет собой желтовато-белый мелкокристаллическийпорошок без запаха, Mr=266,68 г/моль. Ормустин умеренно растворим в воде,мало растворим в ДМСО, очень мало растворим в спирте 95% и практическинерастворим в ацетоне и гексане.
Структурная формула ормустина представленана рисунке 8 (стр. 34).Вспомогательные компоненты:1. Kollidon 17 PF (BASF The Chemical Company, Германия), Ph Eur, USP, JP;2. Kollidon 12 PF (BASF The Chemical Company, Германия), Ph Eur, USP, JP ;3. Kollisolv PEG–400 (BASF The Chemical Company, Германия), Ph Eur, USP,JP;4. Декстран 70000 (Sigma-Aldrich GmbH, Германия), Ph Eur;5.
Калия фосфорнокислый однозамещенный, х.ч. (Химмед, Россия);6. Кислота лимонная (Цитробел, Россия), ФС.2.1.0024.15;7. Лактоза безводная (Химмед, Россия), ГОСТ 33567-2015;8. Маннит (Химмед, Россия), ГОСТ 8321-74;9. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, х.ч. (Химмед,Россия), ГОСТ 4172-76.Растворители:1. Аммиак водный 25%, о.с.ч. (Химмед, Россия), ГОСТ 3760-79;2. н-Бутанол, ч.д.а. (ЗАО Экос-1, Россия), ГОСТ 5208-2013;3.
Вода очищенная, ФС.2.2.0019.15;4. Вода для инъекций, ФС.2.2.0020.15;385. Гемодез-Н, раствор для инфузий (Биок, Россия);6. Глюкоза, раствор для инфузий 5 % (Биосинтез, Россия);7. Кислота соляная х.ч. (ЗАО «Мосреактив», Россия), ГОСТ 3118-77;8. Ледяная уксусная кислота (ЛУК), х.ч. (ЗАО «Мосреактив», Россия), ГОСТ61-75;9.
Натрия хлорид, раствор для инфузий 0,9 % (Биохимик, Саранск);10. Пропанол-2 (изопропиловый спирт), о.с.ч. (Химмед, Россия), ТУ 2632-18144493179-2014;11. Рингер, раствор для инфузий (ЗАО «Рестер», Россия)12. Спирт этиловый 95%, ФС.2.1.0036.15 (ЗАО «Брынцалов-А» Ферейн,Россия);13. Хлороформ (трихлорметан) стабилизированный, х.ч. (Химмед, Россия), ТУ2631-066-44493179-01;14. Этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), х.ч.
(Химмед, Россия),ГОСТ 22300-76.Реактивы для анализа:1. Йод кристаллический, ч.д.а. (Химмед, Россия);2. Нингидрин (Sigma Spray Reagents, USA).Вспомогательные материалы для фильтрации:1. Нейлоновые мембранные фильтры «Pall» N66 с диаметром 25, 47 мм иразмером пор 0,22 мкм (Pall Corporation, США; ООО Палл Евразия, Россия);2. ФильтрационнаясистемаStericupGPMilliporeExpressPlusполиэфирсульфоновыми фильтрами, имеющими размер пор 0,22 мкм.Материалы для хроматографии (ТСХ, ВЭЖХ) и СФМ:1. Хроматографическая колонка C 10/20 (Amersham Biosciences, Швеция);2.
Хроматографические пластинки «Sorbfil» ПТСХ-АФ-А, 10×15 см (Россия);3. Стеклянная камера с крышкой для ТСХ-анализа;4. Кюветы с крышкой для спектрофотометрии (Россия).Оборудование:1. pH-метр HANNA рН 211 (Hanna Instruments, Германия);с392. Весы аналитические Sartorius 2405 (Sartorius AG, Германия);3. Весы лабораторные Sartorius LA1200S (Sartorius AG, Германия);4. Водяная баня Büchi Heating Bath B-490 (Büchi Labortechnik AG Швейцария);5. ВЭЖХ хроматограф Agilent 110 с колонкой Phenomenex Luna C 18(2)(Agilent, США);6.
Дозатор Dispensette (BRAND, Германия);7. МешалкаверхнеприводнаямеханическаяRZR2021Heidolphспропеллерным перемешивающим элементом PR 30 Heidolph (Heidolph,Германия);8. Моечно-дезинфекционная машина Lancer 1400 UP DIN (Lancer, Франция);9. Полуавтомат ПЗР-34-ВИПС-МЕД для укупорки флаконов колпачками К-220 и К-3-34 (ООО «Фирма «ВИПС-МЕД», Россия);10.Система получения воды для инъекций УВОИ-М-Ф/1812 (Медиана Фильтр,Россия);11.Спектрофотометр Cary 100 (Varian, Inс., Австралия);12.Стеклянный фильтродержатель в комплекте с колбой Millipore (Millipore,Франция);13.Стерилизатор сухожаровой Binder ED (Binder, Германия);14.Сублимационная сушка «Edwards Minifast DO.2» (Ero Electronic S.p.
A.,Италия);15.Ультразвуковая ванна Transsonic T310 (Elma, Германия);16.Экструдер LipexTM Thermobarrel Extruder 10 мл (Northern Lipids Inc., LipexBiomembranes, Inc., Канада).Материалы для проведения биологических исследованийПри доклиническом исследовании использованы перевиваемые опухолимышей, полученные из Банка опухолевых штаммов ФГБУ «НМИЦ онкологии им.Н.Н. Блохина» Минздрава России: лимфоцитарная лейкемия Р-388, лимфоиднаялейкемия L-1210, эпидермоидная карцинома легкого Льюис (LLC), меланома В16, рак шейки матки РШМ-5.40Исследования проводили на иммунокомпетентных мышах линий C57Bl/6j,DBA/2 и СВA (доноры опухолевого материала) и гибридах первого поколенияBDF1 (C57Bl/6j×DBA/2) массой 18–22 г, самки и самцы. Мышей получали изпитомника лабораторных животных «Столбовая», а также из отделениялабораторных животных ФГБУ «НМИЦ онкологии им.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
