Диссертация (1141395), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Даннаясубстанция одинаково хорошо растворима в ДМСО и ДМФА, однако дляпроведенияспектрофотометрическогоанализанеобходимоприменятьнаиболее прозрачные растворы, поэтому измерения проводили для растворовЛХС-1208 в ДМФА. Данные растворы имеют характерный ЭСП: в области200–500 нм наблюдаются максимум поглощения при 287±2 нм, плечо при306±2; максимум поглощения при 320±2 нм, плечо при 343±2 нм, слабоинтенсивный максимум при 420 нм (рис. 13). Отношение значенийоптической плотности в максимумах A320 /A287 составляет 1,42±0,05.Рис. 13.
ЭСП субстанции ЛХС-1208 (0,0006% раствор в ДМФА)Рабочей концентрацией раствора ЛХС-1208 выбрали концентрацию0,006 мг/мл – 0,008 мг/мл; при этом величина оптической плотности89укладываетсявинтервал, рекомендуемыйГФXIII,амаксимумы поглощения в растворах субстанции и ЛФ совпадают (Рис. 14).Рис. 14. ЭСП раствора ЛФ-лио ЛХС-1208 (0,0006% раствор в ДМФА)4.2.2. Изучение влияния ВВ на спектрофотометрическое определениеЛХС-1208 в ЛФ (оценка специфичности)При разработке спектрофотометрической методики количественногоопределения необходимо учитывать влияние ВВ, входящих в состав ЛФ наспектральные характеристики ДВ. В данном случае на разных этапахразработки ЛФ в состав моделей включались такие ВВ как ДМСО,Cremophor ELP, Kollidon 17PF в разных количествах.На рис.
15 и 16 представлены ЭСП растворов Cremophor ELP с ДМСОи Kollidon 17PF в ДМФА. Из рисунков видно, что эти растворы в области 270нм – 350 нм не имеют собственного поглощения и, следовательно,присутствие Cremophor ELP, ДМСО и Kollidon 17PF не мешает определениюДВ, поэтому в качестве раствора сравнения возможно использование ДМФАбез добавления ВВ.Исходя из вышеизложенного, ЭСП ЛХС-1208 может использоватьсядля идентификации и количественного определения ЛХС-1208 в ИЛФ-лио, априменяемаяметодикаявляется специфичной.спектрофотометрическогоанализаЛХС-120890Рис. 15.
ЭСП раствора Cremophor ELPс ДМСО в ДМФАРис. 16. ЭСП раствора Kollidon 17PFв ДМФА4.2.3. Оценка соблюдения закона Бугера–Ламберта–БераДля проверки соблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера при λmax 320нм готовили растворы субстанции ЛХС-1208 в ДМФА в диапазонеконцентраций от 0,003 мг/мл до 0,010 мг/мл.1 мг субстанции ЛХС-1208 помещают в мерную колбу вместимостью100 мл и доводят до метки ДМФА (раствор А). Далее готовят растворы: 5 млраствора А + 5 мл ДМФА; 4 мл раствора А + 6 мл ДМФА; 3 мл раствора А +7 мл ДМФА; 3,5 мл раствора А + 6,5 мл ДМФА. Измеряют оптическуюплотность рабочего раствора относительно ДМФА на спектрофотометре вмаксимуме при длине волны 320±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.Результаты измерений приведены в табл.
14.Графикзависимостиоптическойплотностиотконцентрациипредставлены на рис. 17. Из рисунка видно, что во всем исследуемомдиапазоне концентраций наблюдается линейная зависимость оптическойплотности от концентрации, что указывает на соблюдение закона БугераЛамберта-Бера в обоих максимумах поглощения.91Таблица 14Проверка соблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера для растворовЛХС-1208 в ДМФА при λmax 320 нм№СAмг/мл320±21.0,01111,2052.0,005550,6010,004440,4834.0,003890,4245.0,003330,3673.Навеска, мг1, 11 мгРис.
17. Зависимость величины оптической плотности от концентрациирастворов ЛХС-1208 в ДМФА при λmax 320 нм4.2.4.Определениемаксимумапоглощениядляколичественногоспектрофотометрического анализа ЛХС-1208 в ЛФВ качестве аналитической выбирали длину волны, при которой пикЛХС-1208 имеет наибольшее разрешение и интенсивность. В максимуме приλmax 320 нм наблюдается более интенсивное поглощение, поэтому он былвыбран в качестве аналитического сигнала.92Для снижения систематических ислучайныхошибокприопределении ЛХС-1208 в ЛФ в методику спектрофотометрического анализаввели способ расчета по СО.
В качестве СО использовали субстанцию ЛХС1208.4.2.5. Количественное определение ЛХС-1208 в ИЛФ до и послелиофилизацииОптическую плотность анализируемых растворов измеряли при длиневолны 320±2 нм с использованием в качестве раствора сравнения ДМФА.Концентрация исследуемых растворов ЛХС-1208 в ДМФА подобрана такимобразом, чтобы оптическая плотность находилась в области значения 0,5.Приготовление СО ЛХС-1208Точную навеску субстанции ЛХС-1208 9,0 мг количественно переносятв мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят ДМФА до метки (раствор А).Отбирают 1 мл раствора А в колбу вместимостью 25 мл и доводят ДМФА дометки (раствор Б).
Раствор Б используют свежеприготовленным.А. Методика спектрофотометрического определения ЛХС-1208 в ИЛФ3 мл ИЛФ ЛХС-1208 помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл идобавляют небольшое количество ДМФА, перемешивают, доводят ДМФА дометки и перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мернуюколбу вместимостью 25 мл, доводят ДМФА до метки и перемешивают(раствор Б).
Измеряют величину оптической плотности раствора Б в кюветахс толщиной оптического слоя 10 мм в максимуме поглощения относительнораствора сравнения. Параллельно проводят измерение оптической плотностираствора СО субстанции ЛХС-1208 относительно раствора сравнения.Концентрацию ЛХС-1208 в ИЛФ (Х, мг/мл) рассчитывают по формуле:Х= А×а0/ А0×1,где: А и А0 – соответственно оптические плотности растворов образцаИЛФ и СО ЛХС-1208; а0 – навеска СО ЛХС-1208, в мг; 1 – 1 мл образца ИЛФЛХС-1208.93Таблица 15Результаты количественного определения ЛХС-1208 в ИЛФ№ образца ИЛФКонцентрация ЛХС-1208 вОптическая плотностьЛХС-1208образце ИЛФ, мг/мл10,5842,8420,5762,8030,5742,7940,5732,7850,5792,8160,5852,842-4Статистическиеn=6, f=5, хср=2,81, S =6,4×10 , S=2,5×10-2,характеристики Sхср.=1,03×10-2, t (Р,f)=2,57 (P=95%), ∆х=0,026, ε= 0,94%Ошибка определения ЛХС-1208 в ИЛФ по данной методике составила0,94%, что указывает на высокую точность разработанной методики анализа(табл.
15).Б.МетодикаспектрофотометрическогоопределенияЛХС-1208влиофилизатеСодержимое флакона ИЛФ-лио ЛХС-1208 растворяют в ДМФА,количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводятДМФА до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А помещают вмерную колбу вместимостью 25 мл, доводят ДМФА до метки иперемешивают (раствор Б). Измеряют величину оптической плотностираствора Б в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм в максимумепоглощения относительно раствора сравнения.
Параллельно проводятизмерение оптической плотности раствора СО субстанции ЛХС-1208относительно раствора сравнения.Содержание ЛХС-1208 во флаконе (Х, мг) рассчитывают по формуле(разведения образца ИЛФ-лио и СО ЛХС-1208 одинаковы):Х= А×а0/ А0,94где: А и А0 – соответственно оптическиеплотностирастворовобразца ИЛФ-лио и СО ЛХС-1208; а0 – навеска СО ЛХС-1208, в мг.Таблица 16Результаты количественного определения ЛХС-1208 в ИЛФ-лио№ образцаИЛФ-лиоЛХС-1208123456СтатистическиехарактеристикиОптическая плотностьСодержание ЛХС-1208 вобразце ИЛФ-лио, мг/флакон0,7659,300,7619,250,7699,350,7669,310,7639,270,7619,252-3n=6, f=5, хср=9,288, S =1,28×10 , S=3,58×10-2,Sхср.=1,46×10-2, t (Р, f)=2,57 (P=95%), ∆х=0,0375, ε=0,40%Ошибка определения ЛХС-1208 в лиофилизате по данной методикесоставила 0,40% (табл. 16).На основании результатов, можно сделать вывод о том, что данныйметод позволяет с большой точностью определять содержание ЛХС-1208 вЛФ.4.2.6.
Валидация методики спектрофотометрического анализа ЛХС-1208Для аналитической методики количественного определения ДВ,согласно сводной таблице Committee on Proprietary Medical Products,Руководства ICH (International Conference on Harmonization) Q2A [11],необходимо определить правильность, прецизионность, специфичность,линейность, диапазон применения (аналитическая область).Определенааналитическаяобластьметодикиколичественногоопределения ДВ, которая рекомендована данными документами в интервалеот 80 до 120% от номинального значения аналитической характеристики.95СпецифичностьСпецифичность – это способность аналитической методики даватьправильный результат определения вещества в присутствии сопутствующихкомпонентов.
Оценка специфичности методики представлена в разделе 4.2.2.ЛинейностьЛинейность предложенной методики анализа определяли путемдоказательства линейного соотношения между концентрацией действующеговещества ЛХС-1208 в ЛФ и величиной сигнала (значение оптическойплотности).Приспектрофотометрическоговалидациианализаразработаннойеелинейностьметодикипроверялиэкспериментально измерением аналитических сигналов для 5 проб сразличными концентрациями ЛХС-1208в диапазоне от 80 до 120%.Значение оптической плотности для каждой пробы получали путем расчетасреднего значения из нескольких измерений. Затем определяли среднююоптическую плотность из ряда определений для каждой концентрации ипроводили статистическую обработку данных с построением и решениемуравнения регрессии вида y=a+bx.ДляэкспериментаготовилимодельныесмесиИЛФ-лио,представляющие собой растворы Kollidon 17 PF и ЛХС-1208 в ДМСО сконцентрациями ДВ от 2,4 до 3,6 мг/мл (табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
