Диссертация (1141356), страница 11

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 11)

Большое внимание уделяется использованию мезенхимальныхстволовых клеток (МСК) в клеточных технологиях. Эти клетки могут быть получены изразнообразных источников, таких как жировая ткань, пуповинная кровь, плацента или костныймозг. Методы для его получения: от клипирования пуповины после рождения ребенка,пунктирование костного мозга из кости с помощью шприца, дренирования подкожной жировойклетчатки до незначительных хирургических процедур, например, извлечение хряща. В отличиеот плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток, дифференцировку МСК прощеконтролировать и управлять ими. Для производства БМКП используются только митотическиактивные клетки с высоким уровнем пролиферации и метаболизма [134].Типичные способ получения разнообразных клеток из забранного материала являетсяафарез – медицинская технология, при которой различные компоненты крови человекаотделяются под действием центробежных сил.

Кровь может быть разделена на плазму,лейкоциты, тромбоциты и эритроциты. Данный метод широко используется для производстваконцентратов эритроцитов и тромбоцитов в трансфузионной медицине. В зависимости от того,какой тип клеток должен быть изолирован, выбирается устройство афареза, разрабатываетсяпрограмма центрифугирования, предназначенная для данного типа клеток и создается протоколафареза. Чтобы найти подходящую программу центрифугирования, необходимо проведение«тестовых пробегов».41Особый случай представляет собой мобилизованный афарез для выделения обогащенныхгемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Необходимо предварительное введение доноругранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ).

Через три-пять дней количестволейкоцитов значительно увеличивается и гемопоэтических прогениторных клеток (суррогантыхмаркеров фракции CD34+) становится больше в периферической крови. Оба продукта(мобилизованная и немобилизованная периферическая кровь) в настоящее время используется вкачестве исходного материала. Процедура обогащения также применима для мононуклеарныхклеток или лейкоцитарной пленки.

Мобилизация должна быть одобрена компетентнымиорганами, т.к. представляет собой дополнительные риски возникновения нежелательныхреакций у донора.Афарезное оборудование и расходный материал (наборы для афареза) являютсялицензированными медицинскими изделиями и доступны в виде стерильных одноразовыхпластиковых материалов высокого качества.Важно отметить, что состав исходного материала не может быть стандартизован в связи сразличными физиологическими характеристиками доноров, различных протоколов забрабиоматериала и используемых инструментов. Поэтому, к примеру, в биоматериале дляполучения ГСК определяется минимальная требуемая доза прогениторных клеток, а составостальных клеточных компонентов определяется полностью.2.3. ПроцессингКак только исходные материалы поступили на производство и подвергаются дальнейшейобработке, наличие действующей лицензии на производство БМКП является обязательным.В большинстве своем гетерогенные исходные материалы обрабатываются с цельюполучения более или менее чистой популяции определенного типа клеток.

Эти изолированныеклетки могут использоваться нативно или использоваться в производстве БМКП. Обработкаможет включать простое размножение, дифференцировку и даже генетические модификации.МСК могут быть изолированы с высокой степенью чистоты за счет их способности к адгезии кпластику. Клетки растут свободно, и могут быть легко удалены посредством последовательныхэтапов изменения субстрата.Одной из стандартных процедур для разделения крови на основные компоненты являетсяцентрифугирование в градиенте плотности с помощью растворов с высокой молекулярноймассой, например, полисахаридов. Процедура подходит для получения мононуклеарныхлимфоцитов из периферической крови, костного мозга и пуповинной крови.

Поскольку42процедура происходит в открытой системе, необходимо создание условий чистых помещенийклассов A и B.Клетки, которые являются частью более прочной ткани, требуют первоначальногоотделения от других клеток и соединительной ткани. В большинстве случаев, это делается спомощью ферментативных методов (с помощью коллагеназы и трипсина) или механическимдезагрегированием (с помощью блендера, шаровой мельницы, или ступки с пестиком). Протеазыразрушают внеклеточный матрикс, разрушают клетки, освобождают клетки из тканей, которыезатем культивируются для получения чистых клеточных линий.

В случае с механическимразрушением, процесс приводит к изменениям клеток и межклеточной связи, однако, силуизмельчения необходимо контролировать, чтобы не разрушить всю фракцию клеток. Данныепроцедуры должны быть стандартизованы, что практически невозможно, когда ониосуществляются вручную.Крометого,зарубежныепубликации[104]описываютметодикумагнитно-активированной сортировки клеток (MACS).

Нужный тип клеток метят антителами, связаннымис магнитными бусинами (микрочастицами). Клетки затем наносятся на колонку, содержащуюферромагнитный матрикс. Колонка помещается напротив магнита. Проточная фракция,лишенная меченых клеток, которые остаются в колонке, собирается. Позитивно отобраннаяфракция размноженных меченых клеток используется в дальнейшем производстве.

Комплексы смагнитными бусинами связываются обратимо с поверхностью клеток и могут быть отделеныпосле отбора. Этот сепаратор (CliniMACS) представляет собой практически изолированнуюсистему, а реактивы – качества GMP-класса. Однако данный аппарат не пригоден длямасштабированных производств, т.к. обработка материала объемом в несколько литров непредставляется возможной.Также описывается иммунофлуоресцентная методика (FACS) выделения целевых клеток,которая позволяет достигать чистоты целевой клеточной фракции до 95%, что имеет значение,когда нецелевые клетки даже в минимальных количествах могут оказать негативный эффект нареципиента. Методика широко используется в исследовательских лабораториях, на производстветребует создания условий класса A/B, т.к.

является открытой системой.432.4. Культивирование клетокКультивирование клеток требует хорошего понимания клеточной биологии и требованийклеток в отношении условий культивирования. Различают клетки, растущие на культуральной«якорной» подложке (адгезивные) и которые растут свободно в виде суспензии. В случаеаутологичного производства, имеется большая потребность в максимизации производственнойпартии. Количество и размер адгезивных клеток ограничивается пространством инкубатора ижелаемые количества могут быть получены только вручную, в отличие от суспендированныхклеточных культур, растущих в колбах.В настоящее время на международном рынке существует множество классическихдвухмерных адгезивных систем (HYPERStacks®, Xpansion®, VueLife® и др.) различныхразмеров с различными покрытиями, частично открытые и изолированные, для культивированияширокого спектра клеток.

Некоторые системы осуществляют поставку культуральных сред,кислорода и питательных веществ без ручного вмешательства. Параметры роста клеточнойкультуры, такие как кислород, парциальное давление, уровень углекислого газа и рН постоянноконтролируются. Адгезивные клетки требуют дополнительный контроль качества – необходимодоказательство того, что конечный продукт свободен от любых фрагментов материала носителя.Это является очень важным фактором, который не так легко выполним.Механическиперемешиваемыесистемымикроносителейявляютсянаиболеераспространенными устройствами, применяемые в качестве биореакторов.

Они используютсядля всех типов клеток, но с разными перемешивающими устройствами и системами воздушногобарботажа,зависящиеотчувствительностиклетоккмеханическомураздражению.Представляется огромная площадь поверхности для роста клеток на микроносителях и, такимобразом, культура не занимает обширные плоские слои культурального пространства. Поставкакультуральной среды и условия культивирования могут изменяться вручную или удаленно вслучае изолированной системы.

При невозможности лопастного перемешивания (например,стволовые клетки восприимчивы к спонтанной дифференцировке в данном случае) применяетсякачательные движения для перемешивания суспензии клеток в одноразовом мешке. Недостаткомэтих систем является отсутствие надежной схемы для отделения клеток от носителя инеобходимость подтверждения отсутствия фрагментов носителя в конечном продукте.Работа с суспензионными клетками в условиях масштабированного производства проще,чем с адгезивными. Типичный способ максимизации выхода клеток будет передача клеточнойсуспензии в ферментер, где просто общий объем клеточной культуры должен быть увеличен.Многие из этих биореакторов в настоящее время используют одноразовые камеры роста дляустранения трудностей стерилизации и снижения риска перекрестного заражения.44Помимо метода культивирования, регуляторные органы требуют свободные отантибиотиков культуральные среды, т.к.

антибиотики могут маскировать микробное заражениеи впоследствии мешают микробиологическому контролю БМКП. Поэтому используются методыкультивирования в изолированных системах, или, по крайней мере, с уменьшенным количествомручного манипулирования, при соблюдении чистоты помещений.Согласно Правилам GMP/GTP, все биологические исходные материалы, например,криопротекторы, фидерные клетки, реагенты, культуральная среда, буферные растворы, энзимы,цитокины, факторы роста) должны быть четко определены [80, 146]. Рекомендуется избегатькомпонентов животного происхождения ввиду их потенциальной опасности передачизаболеваний, например, губчатой энцефалопатии. В качестве замены эмбриональной телячьейсыворотки (FBS) рассматриваются свободные от компонентов животного происхождениякультуральные среды и человеческие сыворотки.Некоторые первичные клетки требуют тесный контакт клетка-клетка или клетка-стимул вначале культивирования.

Запустить новую культуру можно с помощью луночных планшетов.Этот процесс трудоемкий и при этом нежелательный, однако необходимый для некоторыхделикатных типов клеток. Для указанных процедур используемые пептиды, белки, цитокины,факторы роста, а также другие сильнодействующие вещества, которые обеспечивают требуемуюактивность, должны отвечать требованиям качества и безопасности. Часто требуется проведениевалидации производственного процесса на предмет остаточных количеств данных веществ вготовом продукте и их соответствия критериям приемлемости.2.5. Формирование готового продуктаПроцесс формирования готового продукта включает в себя уменьшение объема изаполнение первичной упаковки.В конце производственного процесса основное внимание уделяется получению продуктас максимальной чистотой.

Для этого культуральная среда, включая сыворотки, белки, буферныерастворы и продукты метаболической экскреции должны быть полноценно удалены. Послекультивирования, среду удаляют с помощью центрифугирования, и клеточный осадок остаетсяпрактически чистым веществом. Для определения количества клеток, клетки подсчитываются,затем, посредством введения определенного объема инфузионного буфера (при немедленномиспользовании) или крио-среды (для будущего хранения), достигается желаемая концентрация.Общий объем, объем целевых клеток, минимальная максимальная концентрация должнысоответствовать спецификации на БМКП.

Характеристики

Список файлов диссертации