Диссертация (1141356), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Конечная концентрация клеток в криосреде являетсяключевым моментом не только для того, чтобы обеспечить верную дозировку, но и для45поддержания жизнеспособности клеток при замораживании/размораживании. Проверкастабильности имеет важное значение как для консервированных продуктов, так и для неконсервированных. Для заполнения мешка используется магнитно-активированная система(Например, CliniMACS®), где удаление магнитных бусин является конечной стадиейпроизводственного процесса. Мешок взвешивают, определяют массу готового продукта, егосоответствие объему и забирают образцы для финального тестирования, чтобы установитьпригодность продукта для распределения.
После определения клеточной концентрации(например, с помощью гемоцитометра), высчитывается общее число клеток, и определяетсясколько клеток необходимо удалить, чтобы регулировать дозу. Для снижения концентрациидобавляется буфер.Важным моментом для использования БМКП является определение срока годности,который должен быть достаточно продолжительным, чтобы обеспечить распределение от местапроизводства до места клинического применения.Срок годности должен составлять, какминимум, 48 часов, если применение ожидается не в непосредственной близости отпроизводства.2.6. Контроль качестваК общим требованиям качества, которые подтверждаются соответствующими даннымирегистрационного досье, относят:− клетки должны соответствовать происхождению и стадии дифференцировки поиммунофенотипу;− потенциал дифференцировки должен быть подтвержден гистохимическимиисследованиями;− жизнеспособность клеток и их количество должны быть подтвержденысоответствующими анализами;− стабильность кариотипа клеток должна быть подтверждена;− отсутствие иммуномодулирующего или иммуносупрессивного эффекта после ихвведения реципиенту (если такой эффект не является целью разработки препарата);− отсутсвие ксеногенных клеточных линий;− отсутствие инфицирования клеток бактериальными эндотоксинами, бактериями,микоплазмами, вирусами и простейшими [85].Несмотря на то, что аналитические методики контроля качества БМКП находятся настадии разработки, определенные инструменты уже сейчас описаны в Государственной46фармакопее Российской Федерации XIII издания, Европейской Фармакопее и позволяютохарактеризовать и контролировать качество клеточного продукта.Когда механизм действия БМКП ассоциирован с определенным белком (маркером), могутбыть применены аналитические методики, аналогичные используемым в оценке качества всехпроизведенных биотехнологическим путем протеинов.
Одним из примеров является методпроточной цитометрии – инновационная система анализа, позволяющая определять характерныепризнаки клеток [109]. Кроме того, используются специфические биопробы, иммунохимическиеанализы,исследованияпролиферации,апоптозаиферментативнойактивностидляидентификации клеток и контроля качества [113].Ключ к успешному управлению качеством продуктов на основе человеческих клеток итканей заключается в том, чтобы четко определить критические параметры, подлежащиеконтролю на различных этапах производственного процесса и соответствующих методов анализа[131].
Определенные методы анализа требуются для контроля качества продуктов в процессепроизводства и для получения разрешения на выпуск серии, валидации процессов и дляопределения соответствия и стабильности клеток.Затруднительным в контроле качества клеточных продуктов является определениегенетическойстабильностиклеток.Физиологическийстресс или культивирование влабораторных условиях могут привести к значительному повреждению ДНК и способствоватьклеточнымихромосомнымаберрациям,которыемогутбытьспонтаннымиилирецидивирующими.
Две группы аналитических методов доступны в настоящее время для оценкицитогенетических аномалий: кариотипирование - является ценным методом для анализахромосомнойстабильностицитогенетическиеметоды,входедоклиническихсравнительнаягеномнаяисследований,имолекулярныегибридизацияинуклеотидныйполиморфизм, которые могут быть использованы для поиска рецидивирующих аберраций,вследствие высокой чувствительности и способности определять низкий процент аномальныхклеток.
В некоторых случаях общие методы контроля качества для всех БМКП определитьзатруднительно, ввиду разнообразия клеток и сроков их хранения [128].В случае, когда пациенту вводится смешанные популяции клеток, необходимогарантировать, что результат анализов имеют отношение к популяции, ответственной затерапевтический эффект.Биологическая активность является одним из ключевых параметров БМКП иопределяющей связью между качеством, безопасностью и эффективностью продукта. Оценкаобщих функциональных свойств, таких как рост клеток, выживание и миграция полезна, нонедостаточно специфична для определения активности продукта. В данном случае не подходяттрудоемкие и длительные по времени проведения методы, особенно если продукты47предназначены для немедленного использования после производства, с очень коротким срокомжизни.
В таком случае, применяется «множественный» подход в исследовании активностипродукта, используемом для выпуска серии. Методики анализов должны быть чувствительными,точными, надежными и простыми в проведении [131].2.7. КриоконсервацияКриоконсервирование основано на принципе, что при пониженных температурах (ниже 140оС) химические, биологические и физические процессы существенно замедляются.Особого внимание требуют конкретные требования криоконсервации, например,изменение скорости и температуры во время замораживания и размораживания. Тип камеры дляхранения, процесс помещения БМКП в камеру и извлечение должен сводить к минимумуперекрёстную контаминацию.Клетки сначала охлаждают в контролируемых условиях до -100◦C в морозильной камере,а затем их переносят в резервуар с жидким азотом.
Для успешного криоконсервирования клеток,необходимо следовать стандартизированным и воспроизводимым протоколам. Каждый протоколможет потребовать оптимизации для данного типа клеток или клеточной линии, для достижениямаксимальной жизнеспособности после размораживания.Критическим моментом криоконсервации является использование соответствующейпрограммы замораживания. Скорость охлаждения имеет важное значение и должна тщательноконтролироваться. Когда скорость охлаждения является слишком медленной, клетки могутумереть от осмотического стресса.
С другой стороны, когда скорость охлаждения слишкомвысока, клетки могут погибнуть из-за образования внутриклеточных кристаллов льда. Поэтомувнекоторыхслучаяхможетбытьцелесообразнымиспользованиекриопротекторов(диметилсульфоксид или глицерин).Криоконсервация более высоких объемов (например, в криомешках) имеет решающеезначение, так как весь объем должен быть заморожен гомогенно. Температура поднимается вточке кристаллизации, поскольку образование кристаллов вызывает повышение температуры,что приводит к небольшому повышению температуры раствора. Учитывая этом момент,скорость охлаждения должна быть увеличена, чтобы предотвратить нагревание клеток продукта.В целях тестирования продукта и определения жизнеспособности после размораживаниядополнительные флаконы, как правило, должны быть заморожены из конечного продукта.Необходимо доказать, что продукт, замороженный в криомешке, и опытный образец,замороженный во флаконе, показывают аналогичные результаты.482.8.
МаркировкаПроцесс маркировки является необходимым условием для правильной идентификациилекарственного продукта в процессе производства и после его упаковки.Информация, наносимая на упаковку БМКП, должна прослеживаться в документации наданную серию. Это особенно важно для аутологичных и направленных продуктов, где, зачастую,не представляется возможным сохранить образцы.Особое внимание должно быть уделено этикеткам, которые используются при хранении вусловиях глубокой заморозки (при -80◦C или в паровой фазе жидкого азота при температуре ниже-140◦C). Необходимо провести проверку этикеток на их адгезивную устойчивость при низкихтемпературах в течение длительных периодов времени, и их читаемость.Продукты для аутологичной трансплантации должны помимо основной информациисодержать информацию о доноре/получателе.
В случае направленного донорства, этикеткадолжна идентифицировать реципиента. Когда известно, что ткани и клетки являютсяположительными на предмет инфекционного заболевания, они должны быть помечены как"Биологическая опасность".Дополнительные требования определены для внешней маркировки транспортногоконтейнера. В дополнение к идентификации производителя продукта и, при необходимости,учреждения, осуществляющего клиническое применение, должно быть указано, что сконтейнером следует «обращаться с осторожностью» и «не облучать», чтобы сохранить клеткиили ткани жизнеспособными.Глобальный стандарт ISBT 128 разработан по инициативе ВОЗ с целью стандартизацииобеспечения прослеживаемости предназначенных для трансплантации биологических продуктовчеловека посредством комбинации уникального идентификационного номера донации (DIN) икода продукта.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
