Диссертация (1141239), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Линию механического шваперитонизировали непрерывным швом на атравматичной игле (викрил 4-0).Ширина желудочной трубки после ее выкраивания и укрытия скрепоксерозно-мышечными швами была равна 2,5-3 см (рис.8). На проксимальномотрезке трансплантата (на протяжении 6-8 см) механический шов укрывалиотдельными узловыми серозно-мышечными швами с целью последующегоотсечения избытка во время шейного этапа операции.Рисунок 8. Схема выкраивания изоперистальтической желудочнойтрубки из большой кривизны желудка.76Шейный этап начинали с доступа по внутреннему краю левой грудиноключично-сосцевидной мышцы от уровня перстневидного хряща трахеи дояремной вырезки грудины.
Короткие мышцы шеи (mm. omohyoideus,sternohyoideus, sternothyreoideus) при этом пересекали. Для обеспеченияадекватного доступа к пищеводу пересекали нижнюю щитовидную артерию(рис. 9).Выделив шейный отрезок пищевода брали его на держалку. Натягиваядержалку в аборальном направлении пальцами вдоль стенки мобилизовалипищевод в шейном и верхнегрудном отделах.
Выделив пищевод на всемпротяжении на проксимальный отдел накладывали Г-образный зажим,каудальный сегмент прошивали сшивающим аппаратом УО-40вместе сдлинной прочной нитью и пересекали.Рисунок 9. Схема и топография шейного доступа.Пищевод удаляли через живот. Фиксированную к аборальному сегментуего культи лигатуру при этом проводили в заднем средостении (такимобразом, один конец проводили в брюшную полость, а другой оставляли вране на шее). Желудочный трансплантат привязывали к длинной нити и,помогая рукой, проводили в заднем средостении.
Выведенную на шеюжелудочную трубку фиксировали по всему периметру шестью швами кпредпозвоночнойфасциииокружающимтканям.Формировалипрецизионный ручной шейный анастомоз «конец-в-конец» 2 рядами швов на77атравматичной игле рассасывающейся нитью 5\0. Сначала накладывалиузловые швы на заднюю губу анастомоза и в трансплантат устанавливализонд для декомпрессии и тонкий зонд для энтерального питания, которыйпроводили в тонкую кишку на 20 см дистальнее связки Трейтца.
Второй рядшвовнапереднейстенкеанастомозаформировалиП-образными«салазочными» швами по Березову, которые начинали и оканчивали нажелудочной трубке, отступя на 1 см от линии внутреннего шва. Сначаланакладывали все швы, а затем затягивали их по очереди, обеспечивая темсамым инвагинацию культи пищевода в желудочную трубку (рис. 10).Рисунок 10. Схема формирования ручного шейного анастомозаПо сравнению с методами аппаратного шва, это позволяет не оставлять вобласти анастомоза инородного материала, а значит уменьшить частотуразвитияпослеоперационныхпрецизионногонесравнимыйручногосшваплощадьюстриктур.Приобычнообразуетсядеструкциитканей,несостоятельноститочечныйдефект,развивающейсяпринесостоятельности механического анастомоза (рис.
11).78Рисунок 11. Схема окончательного вида и расположения трансплантатапосле экстирпации пищевода с пластикой желудочной трубкой, иадекватного дренирования заднего средостения.При трансторакальном доступе, в положение больного на левом боку сзаведенной за голову рукой выполняли торакотомию в 5 межреберье (рис.12). Осуществляли ревизию плевральной полости, после лигировании ипересечения непарной вены вскрывали полость заднего средостения (рис.13).Рисунок12.Схемаположениябольногоприосуществлениитрансторакального доступа.Далее мобилизовали пищевод от пищеводного отверстия диафрагмы доверхнегрудной аппертуры, при этом лигировали и пересекали сегментарныесосуды.Послемобилизованныйпищеводпересекалиипрошивалисшивающим аппаратом УО-40 в области верхней и нижней апертур, после79чего удаляли.
В дальнейшем выполняли срединную лапаротомию иосуществляли мобилизацию желудка с выкраиванием из него трансплантатаи формированием анастомоза на шее, из доступа по внутреннему краю левойгрудино-ключично-сосцевидной мышцы от уровня перстневидного хрящатрахеи до яремной вырезки грудины, как это описано выше длятрансхиатальной техники экстирпации пищевода.Рисунок 13. Мобилизация пищевода в заднем средостении.2.5 Молекулярно-генетические методы исследования.Анализ метилирования генов MGMT, CDH1, р16/ CDKN2A, DAPK, RAR-βи RUNX3 в измененном и неизмененном эпителии пищевода2.5.1 Выделение геномной ДНК из опухолевого материалаДля получения ДНК ткани опухоли использовали следующий методвыделения ДНК.Ткань опухоли или материал, полученный с помощью эндоскопии,отмывали 1 ml PBS, измельчали и затем гомогенизировали. Гомогенатпереносили в пробирку, затем добавляли экстракционный буфер (10 мМ TrisНCl, 2 мМ ЭДТА, 4 мМ NaCl, рН=8,0) и протеиназу К до концентрации 50мкг/мл и SDS до 0,5 %.
Инкубировали 2 часа при 37 0С до полученияпрозрачного раствора. Далее проводили экстракцию ДНК равными объемамифенола,смесифенол-хлороформихлороформомспоследующимцентрифугированием и отбором верхней фазы. Полученный в результате80раствор ДНК перемешивали с 1/10 объема 5 М ацетата натрия, рН 5,3, и ДНКосаждали с помощью 2,5 объемов холодного 96% этанола, выдерживалиобразец 30 мин при температуре - 700С.Пробу центрифугировали при 00С 15 мин с ускорением 12000 g.Высушивали осадок ДНК на воздухе и растворяли в 200 мкл ТЕ рН 8,0.ВыходДНКсоставлял25-50мкгна1гткани,вслучаеэндоскопического материала выход ДНК соответствовал примерно 5 мкг наобразец.
После полного растворения ДНК, измеряли ее концентрацию наспектрофлюориметре фирмы «Hoefer» (Германия) и снимали спектрпоглощения в диапазоне от 220 до 320 нм, с целью определения чистотыДНК. При этом проверяли выполнение следующих условий: отношениепоглощения на длинах волн 230нм/260нм 0,5, 260нм/280нм 1,8. Максимумпоглощения наблюдался в районе 260 нм.2.5.2 Рестрикционный анализДля определения аномального метилирования проводилась обработкаопухолевой ДНК соответствующей метилчувствительной рестриктазой HpaIIпо следующей схеме: к 1000 нг геномной ДНК добавляли 10 е.а. фермента и2 мкл соответствующего 10хбуфера, доводили до 20 мкл дистиллированнойводой и оставляли на 10 часов в термостате при температуре оптимальнойдля используемой рестриктазы.2.5.3 Определение аномального метилирования промоторных областейгенов-супрессоров опухолевого роста генов MGMT, CDH1, р16/ CDKN2A,DAPK, RAR-β и RUNX3МетилированиеCpG-островковпромоторныхобластейгеновопределяли при помощи метил-чувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР).
Метод МЧПЦРоснованнаспособностиметилчувствительныхрестриктазгидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, иоставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. ВкачествематрицыдляПЦРиспользовалиДНКгидролизованнуюметилчувствительными рестриктазами HpaII (CCGG) или HhaI (CGCG).81Геномую ДНК (1 мкг) обрабатывали 10 ед активной рестриктазы в 10 мклинкубационной смеси в течение ночи. Для амплификации использовали 150нг гидролизованной ДНК. При проведении ПЦР учитывали присутствиесайтов узнавания используемых рестриктаз в амплифицируемом фрагменте,который содержал не менее трех-четырех HpaII или HhaI сайтов.
В случаемодификации цитозинов в метилцитозин ДНК не гидролизуется, и продуктПЦР может быть выявлен в геле. В отсутствие метилирования сайтовузнавания для используемых рестриктаз, ДНК полностью гидролизуется, ипродукт ПЦР не образуется.ДляисключениямультилокусныеПЦРложноотрицательныхстремяпарамирезультатовпраймеров:одинпроводилифрагментпринадлежал изучаемому гену (MGMT, CDH1, р16/ CDKN2A, DAPK, RAR-β иRUNX3), другой служил внутренним контролем ПЦР (фрагмент гена XL3.2или фрагмент гена CUX1, не содержащие сайтов узнавания указанныхрестриктаз), а третий фрагмент соответствовал гену ING1, и служилконтролем полноты гидролиза.
ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМкаждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мклоднократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ ТрисHCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl2, 10% диметилсульфоксида. Затем добавляли 30 мклвазелинового масла, прогревали смесь при 950С в течение 10 мин ипроводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95 0С – 30 с,отжиг и элонгация при 58-620С – 2 мин 30 с.Таблица 1382Праймеры для исследуемых генов, режимы ихотжига и размерыполучаемых фрагментов.Исследуемый генНуклеотиднаяпоследовательность праймеровУсловия ПЦРРазмерпродукта, п.н.F: tgc cgg cgt cca gcg agg atgR: agg cga ccc aga cac tca ccaF: gccccatctccaaaacgaacaR: tcctccgtatcactt ccc cca67оСMgCl2(mM)3,060оС3,0361F: gaa cgc act caa aca cgcR: agc cag ccc c ctc ttt ctt cF:ggg cag ctt agc aat gtg tcR:aca ctc cga agc agc ctc tcF: cat ttg aag gtt agc agc cccR: cat tta cca ttt tcc agg ctF: ggc aac ccc gtt aaa agt catR: ctt caa ggt gag tgc ggg a60оС3,035260оС3,038060оС3,036060оС3,0250ING1F: gcg cca gcc ccg ccg cct gagR: tgc cga gcc cgt ccg ccg cct65 оС3,0335XL3.2F: ttg gct agc agc aac agt gcR: agt ttg atg gct tct gtg at6003,0180CUX1F: gcc ccc gag gac gcc gct accR: aag cgg tcc agg ggt cca ggc67 оС3,0450Tотж.MGMTСDH1р16/ CDKN2ADAPKRAR-βRUNX3346Рисунок 14.
Примеры определения метилирования генов MGMT,CDH1, р16/ CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом МЧ-ПЦР83Цифрами обозначены ДНК пациентов с ПБ; положительный сигналпоказан стрелкой и в положительных дорожках обозначен звездочками. Нагеле имеется фрагмент соответствующий метилированной форме гена ивнутренний контроль ПЦР.2.6 Изучение отдаленных результатов.С целью изучения отдаленных результатов были обследованы всебольныепищеводомБарретта.эзофагогастродуоденоскопиясВпланвзятиемобследованиябиопсии,входилорентгенологическоеисследование, анкетирование.
Все больные были обследованы в сроки от 6месяцев до 3 лет.Эндоскопическое исследование проводили не ранее чем через 6 месяцевпосле операции, поскольку в более ранние сроки могут сохранятьсявоспалительные изменения в дистальном отделе пищевода. С его помощьюоценивали степень выраженности воспалительных изменений в пищеводе,желудке и ДПК, уровень, на котором располагается пищеводно-желудочныйпереход и зубчатая линия, наличие и протяженность стриктуры всембольным выполняли повторную биопсию с плановым гистологическим игенетическим исследованием полученных образцов ткани.Полипозиционноерентгенологическоеисследованиевыполнялисиспользованием жидкой бариевой взвеси (150 г сульфата бария разведенногов 100 мл воды) в том числе в положении Тренделенбурга.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
