Диссертация (1140228), страница 10
Текст из файла (страница 10)
При этом1) скрининговые методы осуществлялись с помощью следующихфосфолипид-зависимых тестов:- АЧТВ с низким содержанием фосфолипидов (РТТ - LA; STAGO,France).- время разведенного яда гадюки Рассела (Stago, France; dRVVT)53- протромбиновое время с разведенным тромбопластином (TTI, STAGO,France).Если фосфолипид-зависимые тесты были нормальными, то скрининговаяпроба на выявление ВА считалась отрицательной.Удлинение фосфолипид-зависимых тестов (одного или нескольких)диктовало необходимость проведения коррекционной пробы:2) коррекционная проба осуществлялась путем смешивания исследуемойплазмы с нормальной плазмой в соотношении 1:1; 1:4 и 4:1 соответственно сцелью исключения дефицита факторов.Если при добавлении нормальной плазмы фосфолипид-зависимые тестыоставалисьудлиненными,проводилисьтесты,подтверждающиенаправленность циркулирующих ингибиторов против фосфолипидов.3) подтверждающая проба - для этой цели использовались лизатытромбоцитов (PNP, STAGO, France) и гексагональный фосфолипид (Staclot,Stago, France).Укорочение АЧТВ до нормы свидетельствовало об антифосфолипиднойприроде циркулирующих ингибиторов.На IV этапе в ряде случаев проводилось дифференцирование другихпричин нарушения свертываемости крови - дефициты отдельных факторов идругие специфические антикоагулянты.НижеприводитсяалгоритмпроцедурыопределенияВАприиспользовании разных фосфолипид- зависимых скринирующих тестов (рис.
6).Мы считаем крайне важным правильную интерпретацию результатовисследования и исключение ложноположительных результатов. Поэтомунеобходимо учитывать, что1) удлинение АЧТВ и каолинового времени может быть при:- приеме прямых и непрямых антикоагулянтов;- дефиците факторов внутреннего пути свертывания;- циркуляции специфических и неспецифических антикоагулянтов;54- дефиците витамина К как следствия мальабсорбции и длительнойантибиотикотерапии;- механической желтухе;- коагулопатии потребления;-гиперфибринолизе.Рис. 6.
Алгоритм определения ВА.а) с использованием АЧТВАЧТВ удлиненоТромбиновое времянормальноеудлиненокоррекционая пробанейтрализация гепаринакоррекциянет коррекции(дефицит факторов)нет коррекции(аномалии фибриногена)коррекция(гепарин)подтверждающая пробас фосфолипидаминет коррекциикоррекция(специфический ингибитор)(волчаночный антикоагулянт)б) помощью времени разведенного яда гадюки Рассела (dRVVT)dRVVT удлинено55коррекционная пробанет коррекциикоррекцияингибиторыдефицит факторов(V или Х)подтверждающая пробас фосфолипидаминет коррекции(ингибитор фактора V)коррекция(волчаночный антикоагулянт)2) удлинение dRVVT может быть при:- циркуляции ВА;- циркуляции ингибитора фактора V;- дефиците факторов V, Х и I;- приеме прямых и непрямых антикоагулянтов.3) удлинение протромбинового времени в тесте с разведенным тромбопластином может быть при- приеме прямых и непрямых антикоагулянтов;- дефиците факторов внешнего пути свертывания;- циркуляции специфических и неспецифических антикоагулянтов;- дефиците витамина К;- механической желтухе;- коагулопатии потребления.56Также проводилось определение концентрации АФА (IgA, IgG, IgMиммуноферментным методом (Stago, Asserachrom APA).
Средние титры – 20-40GPlU/ml; высокие - > 40.7. Всем беременным с выявленной мутацией МТHFRС677Т проводилосьопределение концентрации гомоцистеина в плазме крови, иммуноферментнымметодом с использованием реактивов Axis® фирмы Axis-Shield AS, Норвегия наприборе ANТОS 2020, США (табл. 4).Таблица 4Определение степени гипергомоцистеинемииПоказатель (мкмоль/л)Гипергомоцистеинемия15- 30Легкая степень31-100Средняя степень> 100Тяжелая степень7.
Глобальная оценка функционирования системы протеина Сосуществлялась коагулометрическим методом с использованием коммерческихнаборов «Парус»-тест фирмы «Технология-Стандарт», Барнаул, Россия на приборе«START 4» (Stago, Франция).8. Уровни PAI-1, АТ III и протеина С определялись методомсинтетических хромогенных субстратов Stago, Франция на спектрофотометре сдлиной волны 405 нм на приборе ST 88 Diagnostica Stago.9. Уровни сосудистого эндотелиального фактора ростаУровни сосудистого эндотелиального фактора роста определялись с 20-гопо 24-й день менструального цикла иммуноферментым методом наборомкоммерческих реактивов фирмы eBioscience Human (Австрия).10.
Выявление генетически обусловленных форм тромбофилииМолекулярный анализ генетических дефектов гемостаза FV Leiden/1691G-A/,мутациигенафолатзависимогофермента57метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR C677T, а также мутация в гене PtG20210A выполнялась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).Основные этапы выявления генетических дефектов гемостаза включали:-выделение ДНК;-амплификацию (методом ПЦР);-рестрикцию.Молекулярный анализ генетических дефектов FVLeiden /1691G-A/,MTHFRC677T, Pt G20210А выполнялся постановкой полимеразной цепнойреакции.
Этот метод амплификации ДНК in vitro обеспечивает выявление даженезначительных изменений в генах. Принцип ПЦР заключается в циклическойденатурациисобразованиемматричныхцепей,гибридизацииолигонуклеотидов, комплементарных синтезируемой ДНК и называемых пр.1.ОпределениемутациивгенеС677Твгене5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) человека методом ПЦР.Мутация С677Т в гене MTHFR человека представляет собой заменуостатка цитозина в положении 677 на остаток тимина.В результате мутации изменяется последовательность аминокислотполипептидной цепи фермента, что делает его термолабильным, приводит кдефициту цитоплазматической MTHFR и повышению уровня гомоцистеина вплазме крови из-за подавления его метаболизма. С помощью ПЦРпроизводитсяамплификацияизменяемогоподучасткадействиемДНКмутации.обследуемогоПриэтомпациента,содержаниеамплифицируемого фрагмента ДНК в пробе увеличивается в ~108 раз посравнению с исходным.
Процесс амплификации совершается при повторныхциклахтемпературнойденатурацииДНК,отжигаолигонуклеотидныхпраймеров на комплементарных последовательностях ДНК и последующейдостройке полинуклеотидных цепей с этих праймеров термостабильной ДНКполимеразой. Мутация С677Т приводит к образованию нового сайгарестрикции для рестриктазы HinfI. Поэтому рестриктаза может расщеплять вэтом месте мутантный, но не нормальный продукт ПЦР. По окончании ПЦР58образовавшийся фрагмент ДНК инкубируют с рестриктазой HinfI и продуктыреакции анализируют электрофорезом в агарозном геле. При наличии мутацииобнаруживают образование двух низкомолекулярных полос, образовавшихсяпод действием фермента. При этом полное расщепление продукта ПЦРсвидетельствует о наличии в анализируемой ДНК гомозиготной формымутации C677Т, а частичное - гетерозиготной (рис.
7).Продукты ПЦР становятся видимыми в 3% агарозном геле послепрокрашиваниябромистымэтидиемблагодаряихфлюоресценциивультрафиолетовом свете. В результате полимеразной цепной реакции (38циклов) образуется фрагмент ДНК длинной 205 нуклеотидных пар. Инкубацияпродукта ПЦР с рестриктазой HinfI не сопровождается его расщеплением приотсутствии мутации С677Т (дорожки 2 и 5 рис. 10), полное расщепление собразованием фрагментов ДНК длиной 116 и 79 пар нуклеотидов (дорожка 8),происходит при наличии гомозиготной формы мутации и при гетерозиготноймутации - частичное ращепление (дорожки 1, 3, 4, 6, 7, 9).Рис.
7. Молекулярный анализ мутации MTHFRC677T2. Определение мутации в гене фактора V Leiden свертывающей системыкрови методом полимеразной цепной реакции.Мутация Leiden в гене фактора V представляет собой замену остаткааденина в положении 1691 на остаток тимина. В результате мутации59происходит замена Arg-506Gln в полипептидной цепи FV. В результате ПЦРамплифицируется участок исследуемой ДНК, измененный под действиеммутации.
Мутация Leiden нарушает сайт рестрикции для рестриктазы Мп1.Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом месте нормальный, но немутантный продукт ПЦР. По окончании ПЦР образовавшийся фрагмент ДНКинкубируютсрестриктазойМп1.Приотсутствиимутациипослеэлектрофореза обнаруживают две низкомолекулярные полосы, образовавшиесяпод действием фермента. Полная устойчивость продукта ПЦР к рестриктазесвидетельствует о наличии в анализируемой ДНК гомозиготной мутации, ачастичная – гетерозиготной формы (рис. 11).ПродуктыПЦРобнаруживаютсяв3%агарозномгелепослепрокрашивания бромистым этидием по флюоресценции в ультрафиолетовомсвете. При проведении ПЦР в пробах, содержащих ДНК человека, образуетсяфрагмент ДНК длинной 205 нуклеотидных пар.
Инкубация продукта ПЦР срестриктазой MnI сопровождается его полным расщеплением при отсутствиимутации Leiden. Расщепление отсутствует при наличии гомозиготной формы(дорожки 3 и 5, рис. 8), при гетерозиготной форме мутации – частичноерасщепление (дорожки 7 и 13).Рис. 8. Молекулярный анализ мутации FVLeiden /1991G-A/.3. Определение мутации G20210А в гене протромбина методомполимеразной цепной реакции.60Мутация PtG20210А представляет собой замену остатка гуанина вположении 20210 на остаток аденина, локализованного в его концевойнекодирующей части. В результате мутации не изменяется последовательностьаминокислот полипептидной цепи протромбина, однако увеличиваетсястабильность его м-РНК, что сопровождается повышением уровня синтезапротромбина и его концентрации в плазме крови.
Мутация PtG020210Анарушает в ПЦР- продукте искусственный сайт рестрикции для рестриктазыТаq I, недостающие нуклеотиды которого вводятся в ПЦР- продукт с помощьюодного из праймеров. Поэтому рестриктаза может расщеплять в этом местенормальный, но не мутантный амплифицированный фрагмент ДНК. Приналичии гомозиготной мутации исходный продукт ПЦР не расщепляетсяферментом. Полное расщепление продукта ПЦР свидетельствует об отсутствиимутации PtG20210А в анализируемой ДНК, а частичное - гетерозиготнойформы мутации (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
