Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 65
Текст из файла (страница 65)
!2.9. Распад тетраэдрического промежуточного соединения, при котором происходит высвобождение аланинамида и образование ацнлфермента. Аланинамид не может остаться связанным с центром связывания уходяшей группы ($ !! из-за слишком тесного контакта с карбонильной группой апилгрермента. стггктхях и мгххнизм двиствия отдвльных фвямантов зт! Ьег-195, завершающаяся образованием тетраэдрического промежуточного соединения (рис.
12.8). В ходеэтой реакции протон гидроксгльной группы перемешается на имидазол остатка Н!з-57 и одновременно протон от другого атома азота этого кольца может переместиться на карбоксилат Азр-102. По мере образования связи между Бег-195 и углеродным атомом карбоиильной группы связь С=О удлиняется, преврашаясь в одинарную. Кислород, несуший отрицательный заряд, приближается к ХН-группе Ыу-!93, образуя более короткую и более прочную водородную связь. Переходное состояние стабилизируется относительно комплекса Михаэлиса за счет уменьшения напряжения между уходящей группой и боковой цепью 5ег-195 и образования более прочной водородной связи с Яу-193. Распад переходного состояния приводит к образованию ацилфермента и выбросу уходяшей группы (рис.
12.9). Уходяшая группа не может связываться с подцентром 5( ацилфермента, так как это приводило бы к слишком сильному сближению аминогруппы и углеродного атома карбонильной группы. Таким образом, в обратной реакции, т. е, при атаке уходягцей группой ацилфермента, энергия связывания с подцентром Я реализуется только в переходном состоянии. Деацилирование происходит при участии системы с переносом заряда, активируюшей атаку молекулы воды. При этом образуется другое тетраэдрическое промежуточное соединение, которое разрушается с высвобождением 5ег-195 и образованием комплекса между ферментом и продуктом. Примечание, В настояшее время получены прямые данные в пользу существования тетраэдрического промежуточного соединения и согласованного переноса протона от 5ег-195 на Н!з-57 и от Н!з-57 на Азр-102 при гидролизе анилидного субстрата„катализируемого сериновой протеазой; Нппкар!!1ег М.
)Ч., Гогпас М. О., К!с)гагбз Л. Н., В!оспеш!з(гу, 15, 5009 (1976). Несмотря на все эти подробности, многие важные аспекты механизма ацилирования все еше неясны. Например, мы не знаем, каким образом энергия связывания И-ациламино-фрагмента субстрата иногда используются для увеличения й,.ь а не для уменьшения Км (табл. 10.1). Нам ие известно, какой вклад в катализ вносит погруженный в белковую глобулу Азр-102, который входит в систему с переносом заряда (какой бы была активность химотрипсина, если бы аспартат был заменен аспарагином).
г. Зимогены Некоторые сериновые протеазы присутствуют в поджелудочной железе в виде неактивных предшественников, которые могут быть переведены в активное состояние путем протеолиза. Так, глАВА !а 372 например, трипсиноген превращается в трипсин в результате отшепления )ч)-концевого гексапептида за счет расщепления энтерокиназой связи между ).уз-б и 1!е-7.
Химотрипснноген активируется с помощью трипсина, расшепляющего связь между лени ак «з ия СТ Т-га „„,аЛлй. ооон , , ~ — й — соон Льоиииьтрингиньгьн 5вг-Лга а-Химьтриньин а~ ь ТИЛг-Льн л лгх м ННз и ннв — глй лвя 1~ ИУ ИВ Лга г)г — - — р-ст ооон ОООН Хииьтриньинтьн р'Химотриньин И7 ИВ т~ тлг-лзл ~ф л га м ьх ив ННа Лгу 77ь ЙНа Сии Лаи И ГХ ит гав сбои ~~ л и м в с с ооон С НН — Тли Льи л-Химьтрингин С м В Гьт Лнь л и-Химотриньин соои а-Хам отри наин ьсьт ая активация Ст т-ВВ Рнс.
12.10. Актнвацня хнмотрнпснногена. 1М1!1ег Э. 1)., Ногьен Т. А., Те!- 1ег Тг. С., В!осйешгз1гу, 1О, 4О41 (1971).1 Т вЂ” трнпснн, С вЂ” хнмотрнпснн, Ста — хнмотрнпсняоген. Прн «быстрой» активация количество трнпснна достаточно для того, чтобы актнвнровать весь знмоген, прежде чем произойдет накопление хнмотрнпснна в результате автолнза. Прн медленной актнвацнн небольшая часть трнпснна медленно активирует знмоген н образовавшийся вначале хнмотрнпснн расщепляет остающнйся неактнвнрованный знмоген с образованием неохнмотрнпснногена.
Агн-15 и !!е-!6. (В этом случае дальнейший протеолиз с по. мощью химотрипсина, высвобождающегося в процессе активации, приводит к образованию различных форм этого фермента.) Механизм активации и причины отсутствия активности у химотрипсиногена были однозначно определены при сравнении кристаллической структуры фермента и зимогена [82 — 841. Зи- СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 373 моген имеет систему с переносом заряда, которая может находиться в тех же самых ионизационных состояниях, что и в ферменте (74, 85].
Однако активность зимогена крайне низка: он лишен протеолитической активности, а его реакционная способность по отношению к синтетическим субстратам идентична реакционной способности имидазола, взятого в соответствуюшей концентрации [86, 87]. Обусловлено это тем, что в зимогене по существу не сформирован карман для связывания субстрата и участвуюшая в образовании водородной связи ХН-группа остатка О(у-!93 занимает невыгодное положение по отношению к субстрату [83].
Этот пример является весьма поучительным. Для ферментативного процесса важно не просто присутствие в молекуле фермента высокореакционноспособной каталитической группы, но и соответствуюшее расположение субстрата и обычных каталитических групп. Конформационное изменение, приводящее к образованию связываюшего кармана и повороту О!у-193, само является результатом перемешения остатка 1!е-16, когда его а-аммонийная группа образует солевой мостик с погруженной вглубь белковой молекулы карбоксильной группой Азр-194.
Процесс активации можно моделировать, изменяя рН. При высоком рН аммонийная группа депротонируется, ионная связь дестабилизируется и фермент принимает зимоген-подобную конформацию. Разность энергий этих двух конформаций мала и они находятся в состоянии тонко сбалансированного равновесия [88]. 2. Тиоловые протеазы (89 — 94] Тиоловые протеазы широко распространены в природе. Ферменты, выделенные из растений,— папани (нанайя — дынное дерево), фицин (фиговое дерево) и бромелаин (ананас) — входят в группу структурно гомологичных ферментов. Они не гомологичны бактериальной тиоловой протеазе клострипаину (из С!ОЕ1г!Жит Б(з!о!уисит) и стрептококковой протеиназе (из гемолитических стрептококков).
Возможно, эти две группы ферментов соотносятся между собой так же, как сериновые протеазы животных и бактерий. Установлено, что у млекопитающих тиоловые протеазы катепсин В1 и В2 встроены в лизосомы. а. Папани (89 — 92] Этот фермент образован единственной полипептидной цепью, состояшей из 212 аминокислотных остатков и имеющей мол. вес 23 406 (95]. Кинетические исследования показали, что активный центр может связать семь аминокислот — четыре с той стороны расщепляемой связи„где находится ацильная группа (подцентры 84 — 81), а три — со стороны аминогруппы (81 — 8з) [96]. 374 глхвх м В отличие от сериновых протеаз, у которых главным специфическим центром связывания служит подцентр Яь у папаина специфичностью к гидрофобным аминокислотам обладает подцентр Зь а за специфичность к изолейцину или триптофану ответствен подцентр 8[ [97).
Гидролиз эфиров, а возможно, и пептидов сопровождается образованием ацилфермеита (как и в случае сериновых протеаз, за исключением того, что ацилируется Суз-25) [98 — 101). График, построенный в координатах [рН; й,.~1Кн), представляет собой колоколообразную кривую с максимумом при рН-6, что обусловлено ионизацией Н(з-159 и Суз-25, рК, которых равен 4,2 и 8,2 соответственно. Обозначим гистидин через 1гп, а цисзеин — через ЙЗН. При низком рН неактивна ионная форма КЯН,Н1т+, тогда как прн высоком— форма КЗ вЂ” Лт.
При нейтральном рН каталитически активная форма представляет собой один из таутомеров — КЯН,[т или КЯ вЂ .Н1гп+; исследование рН-зависимости не позволяет различить два ионных состояния, несущих одинаковый суммарный заряд («принцип кинетической эквивалентности»,гл.2, равд. Е). рН-зависимость й„, для деацилирования определяется ионизацией основания с рК, около 4. Возможно, этим основанием является группа, принадлежащая Н1з-159, поскольку цистеин блокирован в ацилферменте. Механизм реакции можно представить с помощью следующей схемы: 8Н Г /~ о що Е КСОгН+ !яз НХ 11 ! ! 2.23) 8 Е Н!т' Н!т' 1. Структура активного центра папаина [89, 102 †1]. Кристаллографические исследования показывают, что молекула папаина состоит из двух доменов, разделенных глубокой расщелиной, в которой и происходит связывание субстрата, Несмотря на то что Суз-25 и Н!з-159 находятся в тесном контакте, они расположены на разных краях расщелины.
Довольно глубокий карман подцентра 5з, связывающий гидрофобные аминокислоты, образован гидрофобными боковыми цепями Туг-67, Рго-68 и Тгр-69 одного домена и гидрофобными боковыми цепями РЬе-207, А!а-160, Ъ'а!-133 и Ъ'а1-157 — другого. лгкктхгх и механизм дзпствия отднльных езпмзнтов 375 В свое время считали, что значение рК. =4,2, полученное из рН-зависимости активности фермента, относится к карбоксильной группе боковой цепи, поскольку обычно эти группы ионизируются именно в данной области рН.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
