Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 68
Текст из файла (страница 68)
Их ионизацию можно исследовать, воспользовавшись рН-зависимостью активности фермента, оптимум которой находится при рН 2 — 3 и определяется ионизацией кислой формы группы с рК, 4,5 и оснбвной формы группы с рК, 1,1 [!42, 143]. Значения рК. идентифицированы с помощью опытов по связыванию необратимых ингибиторов, способных специфически взаимодействовать с ионизированными или неионизированными карбоксильными группами.
Диазосоединения типа метилового эфира 5)-диазоацетил-).-фенилаланина, взаимодействующие с неионизированными карбоксильными группами, специфически реагируют с 384 ГЛАВА !3 Азр-215 вплоть до рН 5 [уравнение (12.29)] [144 — 146]: (Аер-2 )3) — СО,Н + М,СНСОМНСН(РЬ) СОеМе — (Аер-2)3) — СОиСНеСОМНСН(РЬ)СОеМе+ Мь (12.29) Эпоксиды, специфически реагирующие с ионизируемыми карбоксильными группами, модифицируют Азр-32 [уравнение (12.30) ]. РН-зависимость скорости модификации показывает, что рК, этого остатка менее 3 [147]. (Аер-32) — СО, + СН2 — СНц — ю. (Аер-32) — СО,СН,СНк.
(12.30) ОН НС О Н нс Ь С )! О НС О нс о (12.31) Любой предлагаемый механизм действия пепсина должен объяснять тот факт, что во время реакции образуется как аминофермент, так и ацилфермент. Впервые предположение об образовании аминофермента было высказано около 20 лет назад, когда выяснилось, что пенсии катализирует не только гидролиз, но и транспептидацию [148].
При гидролнзе СЬ3-О(п-Туг образуются такие соединения, как СЬ2-О1п-Туг-Туг и Туг-Туг. Проще всего объяснить этот факт, предположив, что происходит образование аминофермента Š— ЫН(х и что это приводит к переносу аминогруппы на свободную карбоксильную группу при синтезе нового пептида. Данная гипотеза подтверждается результатами недавно проведенных экспериментов по определению соотношения между продуктами, в которых один аминофермент мог образоваться из нескольких субстратов [схема (12.32)] [149 — 150]. (Далее мы всюду через ЫН-Туг будем обозначать тирозин, связанный с другим остатком через ХН-группу, а через 1.еп-СΠ— лейцин, связанный через карбок- Исследование кристаллической структуры фермента при высоком разрешении показывает, что карбоксильные группы двух указанных остатков аспарагиновой кислоты связаны друг с другом водородной связью [145, 146].
Аналогичная картина имеет место при ионизации малеиновой кислоты, имеющей рК, 1,9 и 6,2: СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЯСТВИЯ ОТДЕЛЪИЫХ ФЕРМЕНТОВ сильную группу. Š— ОН + ЦСΠ— (НН-Туг) к со,н Ф Е вЂ” ОН + Ц'Со†(НН-Туг) — о Š— (НН-Туг) — ~ н,о (12.32) ,+ ' Ф Е вЂ” ОН+)Чнг-Туг Ц'СО4Н Предположение об образовании ацилфермента как промежуточного соединения было высказано в 1962 г., когда выяснилось, что пепсин катализирует обмен "0 между Нз'40 и карбоксильными группами СЬЕ-(.-РЬе и СЬЕ-(.-Туг.
Эта гипотеза, как правило, не рассматривалась всерьез до тех пор, пока не было показано, что при гидролизе (.еп-Туг-(.еп образуется (.еп-(.еп, что может быть обусловлено следующим переносом ацильной группы [!52, 153]: З.ее-туг-/.ое О ОН4О' О1 О ~О' СО1-Π— Π— 1.еи.) еи-туг-).ее+ Š— ОН (12.33) ).ее-Еее + Туг-) еи Этот эксперимент был повторен с использованием субстрата с двойной меткой ['4С]1.ец-Туг-['Н]1еп, чтобы показать, что в ходе реакции происходит одновременный перенос амино- и ацильной групп. Было установлено, что образуется как [»Н] 1 ец- [зН] 1.еп, так и ['4С] 1.еп- ['4С] 1.ец [154]. Продукт, меченный "С (его в три-четыре раза больше), образуется в результате переноса ацильной группы, а продукт, меченный »Н,— из ["С] 1.еп-Туг- [ЗН] 1.еп- РН] 1.еп, который образуется из аминофермента согласно схеме (12.32). Следует иметь в виду, что прямых данных в пользу существования промежуточных соединений с ковалентными связями нет.
Возможно, аминогруппа в аминоферменте связана не ковалентно, а просто «активирована». Перенос ацильной группы в ходе реакции (12.33) может происходить и путем прямой атаки (,ец-Туг-(.еп связанного с ферментом (.ец-Туг-( еп. Кроме того, исследования ферментативной реакции в предстационарных условиях не выявили ни одного промежуточного соединения. Если они и образуются, то не накапливаются.
Прежде чем попытаться делать какие-то предположения о механизме реакции, обсудим следующий момент. Если бы образовался аминофермент, в котором аминогруппа связана в ферменте амидной связью с одной из карбоксильных групп, то прн гидролизе в воде, обогащенной Не "О, изотоп 'ЗО должен был бы включаться в фермент: н, о Š— (АЗР-Со) — ННц — Š— (лер-Со "ОН). (12.34) ГЛАВА 1$ 1! О К О вЂ” С ОН Г вЂ” С О МНК' 111 О -С~~ ОΠ— С вЂ” К ,ОН ОН 1 ОН ХНК 1У н,о (12.35) — С О вЂ” С + КСО,Н Н О +1ЧН,К' Ъ'1 ОН вЂ” С О- 1ЧН,К' У Однако по данным, полученным в лаборатории В.
К. Антонова, прн гидролизе в воде, на40ай обогащенной Нзмо,включения мО в фермент не происходит. По окончании катализируемого гидролиза АсРпе-ТугОЕ1 фермент выделяли с помощью гель-фильтрации и две его каталитические карбоксильные группы по отдельности блокировали с помощью реакций (12.29) и (12.30). При гидролизе двух образующихся эфиров в конечных продуктах — НΠ— СнзСОХНСН (РЬ) СозН и НΠ— СН~СН(ОН) К— "0 не обнаружено. Либо эта аминокислота связана с аминоферментом нековалентно, либо, возможно, справедлив следующий предложенный В.
К. Антоновым механизм 1155): ~~о ~Р ()гп-52) С К О Со 1чн,Ру 1чн (Я8п-215) — С К ~~ К' О О 1 И СТРУКТУРА И МВХАНИЗМ ДВПСТВИЯ ОТДЕЛЪНЫХ ФВРМВИТОВ 387 Согласно этому механизму, транспептидация путем переноса аминогруппы осушествляется просто обрашением стадии, ведушей от Гу' к У. Однако для переноса ацильной группы необходимо, чтобы соединение П1 могло распадаться с отшеплением К'ННз и образованием ацилфермента [(Азр-32)— — СОзСОК;(Азр-215) — СОТН]. Не исключено, что возможность распада соединения Ш с высвобождением либо К'ННМ либо КСОзН объясняет те необычные результаты, которые были получены в экспериментах по определению соотношения между продуктами, в ходе которых изучали превращения серии субстратов, протекающие с образованием обшего аминофермента, Е-Тгр, в присутствии акцептора — АСРпе [156). Соотношение между АСРЬеТгр и Тгр, образующимися при гидролизе серии пептидов ХРЬеТгр в присутствии АСРЬе, изменяется в зависимости от природы Х (Х = АСО1у и т.
д.), Обычно этот факт рассматривается как довод против образования общего промежуточного соединения (гл, 7, равд. Б.2.б). Однако относительные скорости отшепления К'НН, (например, Тгр) и КСОгН (например, ХРЬе) должны зависеть от природы фрагмента КСО,Н, и, следовательно, доля образуюшегося аминофермента будет изменяться. Таким образом, соотношение между продуктами реакции в случае механизма (12.35) не должно быть постоянным. Рассмотренный механизм значительно сложнее, чем в случае других протеаз.
Тем не менее всеего стадии вполне приемлемы с точки зрения химии, хотя подобных аналогий в простых химических системах не обнаружено. 2. Зимоген. Пепсин образуется из пепсиногена при отшеплении от Н-конца 44 аминокислотиых остатков. При нейтральном рН зимоген устойчив, а при рН - 5 быстро и самопроизвольно активируется. Активация осуществляется либо в процессе, катализируемом пепсином, либо с помошью внутримолекулярного катализа.
Имеется много данных, свидетельствуюших о том, что пепсиноген самоактивируется в ходе мономолекулярного процесса, при котором активный центр расщепляет свою собственную полипептидную цепь с 5(-конца [157 — 163[. Пожалуй, наиболее изяшным образом это было продемонстрировано при автоактивации пепсиногена, ковалентно присоединенного к сефарозе [!59[. Молекулы зимогена иммобилизованы и не могут контактировать друг с другом. Тем не менее при рН 2 пепсиноген самопроизвольно активируется.
Между двумя путями активации сушествует конкуренция: бимолекулярная активация преобладает при более высоких концентрациях зимогена и при рН выше 2,5, а внутримолекулярная — при низком рН. Результатом самопроизвольной активации чистого зимогена является то, что ГЛАВА 13 большинство молекул пепсиногена становится активным уже через 1О с после смешивания с соляной кислотой в желудке. В. Рибонуклеаза [164, 1651 Панкреатическая рибонуклеаза гидролизует РНК в ходе двухстадийного процесса, при котором в качестве промежуточного соединения образуется циклический фосфат: О О ф Р О О ! ! 2.36) КОН Циклизации обычно протекает значительно быстрее, чем последующий гидролиз, поэтому промежуточное соединение можно легко выделить.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
