Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 64
Текст из файла (страница 64)
Состояние Нзд+ в реакциях с участием химотрипсина не наблюдается даже при рН 2. Если состояние, реализующееся при низком рН, — Н+А-, то погруженный в белок Азр-102 является как раз тем остатком, который увеличивает основность НМ-57 и ответствен за напряжение. Если состояние, реализующееся при низком рН, — НА, то появляется возможность переноса в процессе катализа протона между эег-!95 и НМ-57, сопровождаемое одновременным переносом протона между Н!з-57 и Азр-102. основания приблизительно на 2 единицы и имея в виду, что коэффициент Бренстеда р в случае абшего оснбвного катализа равен 0,6) [741.
б. Структура и реакционная способность субстрата Структурные требования, которым должен удовлетворять субстрат„ чтобы обладать реакционной способностью, определяются из данных по измерению угс.! и Км для широкого круга эфирных субстратов и констант ассоциации для обратимых ингибиторов [78[. Эфиры обладают чрезвычайно высокой реакционной способностью, что налагает ограничение на выбор эфирных субстратов, которые должны гидролизоваться с доступной для измерения скоростью.
Таким образом, эфиры наиболее по- ГЛАВА 1т лезны для определения стерических требований, предъявляемых к ацильному фрагменту субстрата. Амиды и пептиды настолько нереакционноспособны, что использовать можно только производные специфических субстратов — фенилаланина, тирозина и триптофана. Теперь эти исследования удается проводить в сочетании с рентгеиоструктурным анализом. Таблица 12.2 Структурные требования при леацилировании ацнлхимотрипсниов (ЦСОтЕ) (28' С)'! ои длз тадро- лнза исо!сна м-' -' Еса! дл» деаннлн. розапна, с — ! сн— С4НзСН2СНт— Сна(МНСОСН3) Е.санзснзсн(ХНСОСнз)— 0,01 0,178 0,12 111 0.19 0,18 2,48 1,94 «1 Одра!а А., ВесЬе1 ЛМ., Иопсонз С..
В!осЬет. 81орЬтз. Иез. Соппппп., 41, 464 09101; Березин И, В., Казанснаа Н. Ф.. Клесоз А. А., РВВЗ Ье!!а., !а, 1т! 0910; сн. табл. Г.Ъ. 1. Стадия деацилирования. В табл. 12.2 приведены данные по деацилированию различных ацилферментов. Соответствующие данные для аминокислот приведены в табл. 7.3. Наибольшей реакционной способностью обладает производное ацетил-(.-фенилаланина. Как указывалось в гл.
1, в химотрипсине имеется четко выраженный карман для связывания ароматической боковой цепи аминокислоты и центр образования водородной связи (С=О-группа 5ег-214) с ХН-группой в СНзСОХН-фрагменте субстрата (рис. 12.5). При замещении в ацетилфенилаланине СзНзСНт- и СНзСОМН-групп водородом и образовании простой ацетильной группы скорость деацилирования уменьшается в 104 раз (правда, десятикратное уменьшение скорости обусловлено индукционным эффектом СНвСО)Ь)Н-группы, как это видно из значений констант скорости катализируемого гидроксил-ионами гидролиза эфиров; последняя колонка табл.
12.2). Интересно, что в повышении реакционной способности участвуют как ароматическое кольцо, так и ациламиногруппа (табл. 12.2). Ацетилглицинхимотрипсин деацилируется только в 12 раз быстрее ацетилхимотрипсина, и, как видно из значений констант скорости гидролиза, катализируемого гидроксилионами, это увеличение обусловлено исключительно индукционным эффектом ациламиногруппы, а не влиянием связывания.
стникткпя и михлнизм дспствия отдильных оигминтов звт Аналогичным образом 8-фенилпропионилхимотрипсин деацилируется только в 17,8 раз быстрее ацетилхимотрипсина. Причина, по которой за повышение реакционной способности ответственны как ароматическое кольцо, так и ациламиногруппа, была выявлена с помощью рентгеноструктурного анализа. Как отмечалось в гл.
1 и будет показано ниже, карбонильный кислород полипептидного субстрата расположен между !ч!Н-группами полипептидного остова, принадлежащими 5ег-195 и 61у-193. Такой о ны мУ~' о .н' О Ятр Й зег гм Рис. !2.5, Некоторые аыинокислотные остатки хиыотрнпсина, участвующие в связывании и катализе. тип связывания был обнаружен недавно для специфического ацилфермента карбобензокси-Е-аланпнэластазы [79], однако, как оказалось, присоединение карбонильного кислорода неспецифического ацилфермента индолилакрилоилхимотрипсина не приводит в данном случае к продуктивному связыванию [80].
Вместо этого между карбонильным кислородом и каталитическим атомом азота Н1з-57 молекула воды образует мостик из водородных связей (рис. 12.6). Для осуществления реакции карбонильный кислород должен повернуться в сторону центра образования водородной связи между Бег-195 и С!у-193, а связанная молекула воды должна атаковать карбонильный атом углерода. Таким образом, присутствие и ациламиногруппы, и ароматического кольца необходимо для правильной фиксации карбонильной группы. Если какая-либо из этих фиксирующих групп отсутствует, то карбонильный кислород оказывается вовлеченным в непродуктивный тип связывания.
ГЛАВА 12 2. Стадия ацилирования. Как указывалось в гл. 1О, заполнение подцентров Бз, Бз, 8, и Ба часто увеличивает й„! для гидролиза полипептидных субстратов без уменьшения Км. Причина такого явления неизвестна. Энергия связывания с подцентром Я также используется для увеличения й„г, а не для по- — Вагга о о о Ос ©() Ро Рис.
12.6, Кристаллическая структура индолилакрилоилхимотрипсииа. [Непйегвоп К.,,'ь гпо!ес. Вю(., 54, 341 (1970).1 Отметим, что кдрбонильный кислород этого неспецифического ацилфермента связан не с !чН-группами Бег-195 и О!у-193, а непродуктивно присоединен к Н!з-57 через водородную связь с молекулой воды. Установлено, что втот ацилфермент деацилируется в растворе с такой же скоростью, как и в кристалле (гл, !). 1((озз! 6. ~., Вегппагй 5.
й., з, гпо(ес, В!о1., 49, 35 (1970).) вышения прочности связывания. Было высказано предположение, что это обусловлено наличием невыгодных взаимодействий между уходяшей группой и ферментом, которые уменьшаются при образовании тетраэдрического промежуточного соединения (гл. 10, равд. В.б.в) [8Ц. Возможно, между )ь(Н-группами полипептидного остова и отрицательно заряженным кислородом тетраэдрического промежуточного соединения образуются более прочные водородные связи, чем между указанными группами и карбонильным кислородом субстрата, стииктигд и механизм дииствия отдильных окемннтов в.
Описание механизма реакции Кинетические и структурные данные позволяют качественно описать механизм ацилирования химотрипсина хорошим полипептидным субстратом [81!. В специфическом кармане химотрипсина между атомом водорода И-ациламиногруппы субстрата и карбонильной группой Бег-214 образуется водородная связь. Все располагающиеся грг о лф юг ааг гм Рис. 12.7.
Ы-апетил-Е-триптофаналвнинамид, связанный с химотрипсином. Обратите внимание на образование водородных связей между карбонильной группой субстрата и 1чН.группами остатков С1у-193 и Бег-195, Гидроксильная группа иег-195 поворачивается из верхнего положения, занимаемого ею в кристалле фермента, в сторону субстрата. дальше остатки в Я-ациламино-фрагменте связываются с доступными подцентрами. Реакционноспособная карбонильная группа располагается со своим атомом кислорода между ИН-группами Бег-195 и О1у-193 (рис. 12.7).
Однако не исключено, что водородная связь между указанным атомом кислорода и О!у-193 довольно слабая. Уходящая группа помещается в подцентре 5!, «втискиваясь» между ним и боковой цепью Бег-195. Было высказано предположение, что это заставляет реакционноспособную гидроксильную ~руину Ьег-195 в химотрипсине повернуться и занять примерно такое же положение, какое она занимает в переходном состоянии. Однако в трипсине эта гндроксильная группа, по-видимому, частично повернута указанным выше образом и в отсутствие субстрата. Первой стадией химического превращения в этой реакции является атака карбонильного атома углерода субстрата гидрокснльной группой 370 глана !г / и И йо ! гэз l 1 ж о О.
Азу Газ О эег гж Рис. !2.8. Образование тетраэдрического промежуточного соединения. Гидроксильная группа Бег-!95 продолжает поворачиваться и образует связь с субстратом. Прн этом атомы углерода и кислорода карбонильной группы субстрата также перемешаются, возможно образуя более прочные водородные связи с группами полипептидного остова фермента. и ~м Згг гн .О гух г О О Азд глу О уэг 2гт Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
