Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Скорости как прямых, так и обратных реакций очень просто измерить по появлению или исчезновению восстановленного кофермента, который имеет характерный спектр поглощения в ультрафиолетовой области с максимумом ГЛАВА М при ), = 340 нм. Кроме того, восстановленные коферменты при освещении их светом с длиной волны 340 нм флуоресцируют, что дает еше более чувствительный способ их регистрации.
Химическая сторона процесса восстановления НАР+ была изучена в ходе весьма элегантныхэкспериментов [1].Окисление спирта сопровождается отшеплением двух атомов водорода. Один из них переносится непосредственно в положение 4 никотинамидного кольца МАО+, другой высвобождается в виде протона [2, 3]. Обычно считают, что водород переносится в виде Н .Н ОН - С01ЧН, СО1ЧН Н Х 1 К Н (12.11 гидрид-иона Н- (однако не исключено, что образуется промежуточное соединение, являющееся радикалам). Этот перенос стереоспецифичен. Использование дейтерированных субстратов позволило установить, что одни дегидрогеназы переносят водород на одну сторону никотинамидного кольца, а другие — на противоположную [схема (!2.2)]. Исходя из этого ферменты подразделяются на два класса — А и В (табл. 12.1) (см.
также гл. 2, равд. 3). Структура некоторых дегидрогеназ установлена, Эти ферменты, их физические и кинетические свойства подробно рассмотрены в работах [4 — 8]. Приведенные данные позволяют сделать некоторые выводы. Как говорилось в конце гл, 1, в субъединицах фермента можно выделить два домена; катали. тический домен, структура которого существенно различается для разных дегидрогеназ, и домен, связывающий нуклеотид и характеризующийся тем, что его полипептидная цепь уложена одинаковым для всех дегидрогеназ образом. Детали структуры этого домена варьируют от фермента к ферменту, однако во всех случаях кофермент присоединяется в развернутой конформации (рис.
12.1). Наиболее важное изменение касается способа расположения никотинамидного кольца: для ферментов разных классов (А и В) оно обращено к субстрату разными сторонами. 347 СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ОТДЕЛЪНЫХ ФЕРМЕНТОВ Таблица 1з.7 Стереоспецнфнчиость кофермеитов некоторых дегидрогеиаз Необкоднмыа кофермент Стереоспецнфненость (клнсс1 Дегндрогеназы МАР+ или МАРРе МАРР+ Глутаматдегидрогеназа Глюкоза.б-фосфат — де.гидрогеназа З-глицерофосфат-деги. дрогеназа Глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеназа Малатдегидрогеназа (растворимая) Алкогольдегидрогеназа Лактатдегидрогеназа Изоцитратдегидрогеназа В В МАР+ В В А А А МАРР+ рис, 12.1, Свнзывание МАР+ глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеиазой иа Вас111из 41еаго(легтард11из [58(.
348 ГЛАВА М 1. Алкогольдегидрогеназы [5] Алкогольдегидрогеназы — это цинксодержащие металло- ферменты, окисляюшие широкий круг алифатических и ароматических спиртов до соответствующих альдегидов и кетонов и использующие в качестве кофермента НАР+ [см. схему (12.11) ]. Наиболее детально изучены две алкогольдегидрогеназы: из дрожжей и из печени лошади.
Кристаллическая структура апои голоферментов из печени лошади была установлена с разрешением 2,4 [9] и 4,5 А соответственно. Молекула этого фермента представляет собой симметричный димер, состоящий из двух идентичных цепей с мол. весом 40000. Каждая цепь содержит один центр связывания ЫАР4 и два центра связывания Хп''. Непосредственное участие в катализе принимает только один из ионов цинка. Дрожжевая алкогольдегидрогеназа представляет собой тетрамер с мол. весом 145006, каждая цепь которого связывает одну молекулу ХАР4 и один ион Хп'4.
Несмотря на отмеченные различия, предварительные данные по аминокислотной последовательности свидетельствуют о высокой гомологичности этих двух ферментов. Предполагается, что механизм ферментативной реакции для обоих ферментов в принципе одинаков, хотя лимитирующая стадия, рН-зависимость скорости реакции и графики Гаммета могут различаться. а. Структура активного центра алкогольдегидрогеназы печени [5] Ион Хпз+ находится на дне гидрофобного кармана, образованного в месте соединения каталитического н связывающего нуклеотид доменов. Лигандами атома цинка являются атомы серы аминокислотных остатков Суз-46 и Суз-174 и атом азота остатка Н1з-67. Четвертым лигандом служит способная к ионизации молекула воды, связанная водородной связью с гидроксильной группой остатка 5ег-48, который в свою очередь образует водородную связь с Н(з-51, Из рН-зависимости связывания НАР+ [10] и прямого определения количества высвобождаю.
шихся протонов при связывании НАР+ [11] следует, что рК, функциональной группы апофермента равен 9,6, тогда как в голоферменте эта величина составляет 7,6. Кристаллографнческие исследования позволяют предположить, что ионизируется связанная с цинком молекула воды. Никотинамидное кольцо прочно связывается в непосредственной близости от иона цинка на дне гидрофобного кармана. б.
Структура фермент-субстратного комплекса Структура реакционноспособных тройных комплексов фермент — НАРь — спирт и фермент — МАРН вЂ” альдегид (нли ке- сТРУКТуРА и мехАнизм действ!!я Отдельных ФеРментОВ 349 (сус.ггс) 5 ГЗ (Нгг-сг) к и — 5 <сус-сл) 2 Раисссина, с иснс нрсиссигйт санс санит илд' О (е -сс) 'О Н рман ,'с ктисисй с суси сира (Ат .Зг) Рис. 12.2.
Схематическое нзобраигение активного центра алкогольдегидрогена- зы из печени лошади. (С любезного разрешения С.-!. Вгйпбеп.) Г 14Н Н О,' С 'Н (Зсд-СС) О (зги-сг) 14 ~( 1,,> Рис 12.3. Модель продуктивного тройного комплекса алкогольдегидрогеназы из печени лошади Предполагается, что ионизированный спирт замешает связанную с цинком молекулу воды, изобраигенную на рис. 12.2. (С любезного разрешения С..!. Вгапбйп.) ГЛАВА М тон) была определена не прямым способом, а с помощью построения моделей. Проведенные исследования позволяют сделать вывод, что атом кислорода спирта или альдегида (кетона) непосредственно присоединен к иону цинка, а гидрофобная боковая цепь связывается с гидрофобной «полостью» кармана [5].
Эта гипотеза подтверждается проведенными недавно с помощью построения моделей исследованиями взаимозависимости структуры и реакционной способности для ряда замешенных производных циклогексанов [12], спектроскопическими данными [!3] и данными по связыванию [14], показываюшими, что карбонильная группа присоединяется непосредственно к положительно заряженному или кислотному центру (при введении заместителей, являюшихся донорами электронов, в спектре альдегида происходят соответствуюшие изменения, а связывание замешенных бензальдегидов становится более прочным).
Координационное число для иона Хп'« и состояние ионизации спирта в тройном комплексе точно не известны. Согласно одной гипотезе, спирт замешает присоединенную к цинку молекулу воды или гидроксил-ион и связывается в виде ионизированного алкоголят-иона [5]: У,п" [чАР' Н '1 (='о С Г" (12.3) По мнению других авторов [15], недиссоциироваиный спирт присоединяется к иону Уп'+ без замещения молекулы воды; координационное число цинка возрастает до 5. Модель тройного комплекса построена исходя из следующих межатомных расстояний: расстояние между ионом Хп'+ и С-1-атомом спирта равно 3,3 А: расстояние от Хп'+ до центра никотинамидного кольца — 4,5 А; расстояние между С-1-атомом спирта и С-4-атомом никотннамндного кольца составляет 3,5 А [12], в.
Кинетический механизм Исследования дегидрогеназы из печени лошади, проведенные с использованием методов стационарной кинетики и методом остановленной струи, рассматриваются теперь как классиче. ские экспериментальные работы. Они позволили установить, что окисление спиртов представляет собой упорядоченный процесс, стгкктхгх и мвхлпизм дииствия отдвльиых фвгмвнтов 351 первой стадией которого является связывание кофермента, а лимитирующей стадией — диссоциация комплекса фермент— ЗАРН [10, 16, 17]. И теория переходного состояния, и данные стационарной кинетики показывают, что образующийся комплекс фермент — 5[АР+ изомеризуется [17, 18].
Что касается обратной реакции, то при восстановлении ароматических альдегидов лимитирующей стадией является стадия диссоциации комплекса между ферментом и спиртом ]17, 19], тогда как восстановление ацетальдегида лимитируется химической стадией (перенос гидрид-иона). Комплексы между ферментом и продуктом для алкогольдегидрогеназы дрожжей диссоциируют довольно быстро, так что лимитирующими являются стадии химического превращения [20]. Это позволяет измерить кинетические изотопные эффекты для указанных стадий с помощью стационарной кинетики. Установлено, что окисление дейтерированных спиртов ЙСРзОН и восстановление бензальдегидов дейтерированным 5(АРН (т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
