Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 62
Текст из файла (страница 62)
Связывание коферментов также происходит независимо с каждым центром. Играющий большую роль в катализе остаток Н!з-195 обладает необычной реакционной способностью вотношениидиэтилпирокарбоната. Это дает возможность определить рК, (=6,7) как апо-, так и голофермента непосредственно из рН-зависимости скорости модификации [44], Имеются данные о том, что лактат предпочтительно связывается сголоферментом,несущим неионизированный гистидин, тогда как пируват — с комплексом В.МАРН, гистидин которого протонирован.
3. Малатдегидрогеназа [7] Малатдегидрогеназа катализирует обратимое окисление малата до оксаловцетата с использованием в качестве кофермента ХАРа: со; со; 1, 1 Н вЂ” С-ОН+ МАГе~ я=в С=О+ МАОН+ Н+ (12.10) 1 1 сн,со; сн,со; Кристаллическая структура растворимого (цитоплазматического) фермента установлена с разрешением 2,5 А [45]. Карта электронной плотности еще не соотнесена с аминокислотной последовательностью, но, как указывалось в гл. 1, укладка полипептидной цепи фермента в принципе аналогична укладке цепи лактатдегидрогеназы, хотя малатдегидрогеназа является всего лишь димером с мол.
весом 70000. Вероятно, механизм действия обоих ферментов одинаков, поскольку малатдегидрогеназа также содержит важный для катализа остаток гистидина, который может модифицироваться диэтнлпирокарбонатом [46]. Два моля МАРН (или НАР+) связываются с одинаковым сродством [47]. Кажущаяся отрицательная кооперативность при связывании кофермента, обнаруженная для одного из препаратов фермента, может быть обусловлена тем, что на самом деле в препарате присутствовали две формы [48, 49]. СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 887 4.
Глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеиаза 150] Эта реакция протекает через несколько стадий. Адекватность механизма окислительного фосфорилирования [реакции (12.12) — (12.16) ], предложенного в 1953 г. [51], подтверждается всесторонними исследованиями с привлечением данных предстационарной [52] и стационарной [53] кинетики; ОН МАР+.Š— 8Н+ йСНО и:=ь МАР+.Š— 8 — С вЂ” й 1 Н он 1 Ф МАР+.Š— 8 — С вЂ” й ч=~ МАРН,Š— 8 — С + Н+ 1 ~й Н (12.12) (12.13) о .о МАРН.Š— 8 — С ~ —.. Š— 8 — С + МАРН Е вЂ” 8 — С + МАР+ ч-ь НАР+.Š— 8 — С ~l l~ ,ОРО,'- МАР+.Š— 8 — С + НРО', ч=е МАР+.Š— 8Н+ йС '~й ~~о (12.14) (12.15) (12.16) В ферменте имеется реакционноснособный остаток цистеина, который легко ацилируется ацилфосфатами с образованием тиозфира [обратное направление реакции (12.16)] [54].
Первая стадия в приведенной последовательности реакций состоит в образовании полутиоацеталя между цистеином и субстратом. На этой стадии происходит превращение карбонильной группы, трудно поддающейся прямому окислению, в спиртовую группу, легко дегидрирующуюся обычным путем [реакция (12.13) ]. Глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеназа, тетрамерный фермент с мол. весом 150 000, состоит из четырех идентичных цепей; он катализирует обратимое окислительное фосфорилирование глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата с использованием в качестве кофермента 5(АГ7+: н, о О,ОРО[" С С 1 Н вЂ” С вЂ” ОН+МАР'+НРО,'- ч:~ Н вЂ” С вЂ” ОН+МАРН+Н' (12.11) 1 СН,ОРО,'- СН2ОРО]" ГЛАВА М Образовавшийся в ходе реакции (12.13) тиоэфир взаимодействует с ортофосфатом, давая ацилфосфат (12.16).
Однако перенос ацильной группы происходит очень медленнодотех пор, пока НАР+ не присоединится к ферменту [55, 56]. Поэтому обязательным этапом в последовательности приведенных выше реакций является замещение 5!АРН на НАР+ в ходе реакций (12.14) и (!2.15). Интересно, что диссоциация комплекса ацилфермента с 5!АРН (12.14) при насыщающих концентрациях реагента и высоком рН является лимитирующей стадией данной последовательности реакций [55]. Следствием замещения 5!АРН на 5!АР+ до высвобождения ацилфосфата является то, что свободный апофермент не принимает участие в реакции.
Кроме того, поскольку ацилирование фермента дифосфатом активируется НАР+, голофермент инициирует восстановительное дефосфорилирование 1,З-дифосфоглицерата. Комплексы Михаэлиса голофермента с альдегидом или дифосфоглицератом и ацилфермента с ортофосфатом в эту схему не включены, поскольку их константы диссоциации слишком высоки, чтобы могло происходить накопление комплексов. а. Структура фермент-субстратных комплексов Кристаллическая структура голоферментов, выделенных из омара [57] и ВасГ((из зГегоГпегторй!!из [58], была установлена с разрешением 2,9 и 2,7 А соответственно, а структура голофермента человека [59] и бактериального апофермента [58] — с низким разрешением.
Структура фермент-субстратных комплексов определена с помощью построения моделей для фермента, выделенного из омара, и бактериального фермента [57, 58]. Далее мы всюду будем рассматривать данные, касающиеся только бактериального фермента. В активном центре бактериального фермента, полученного в кристаллической форме из раствора сульфата аммония, выявлены два центра связывания сульфат-ионов (рис. 12.1) [60].
Разумную с точки зрения химии и стереохимии схему реакции можно построить, предположив, что один из этих двух центров представляет собой центр связывания фосфатного остатка субстрата, а другой — центр связывания фосфатного остатка, принимающего участие в реакции деацилирования (!2.16). Когда 3-фосфат образует водородные связи с гидроксильной группой ТЬГ-!79, положительно заряженной боковой цепью Агй-231 и 2'-гидроксильной группой рибозного кольца, присоединенного к никотинамиду НАР+, альдегидная группа субстрата может образовывать с остатком Суз-149 полутиоацеталь (рис.
12.1). Затем гндроксильная гртппа субстрата В положении С-2 может образовать водородную связь с Бег-148, а гидроксильная группа стгзктггх и мзххнизм дзиствия отдзльных езгмвнтов 359 в положении С-1 — с атомом азота остатка Н(з-176. В результа- те субстрат будет расположен таким образом, что атом водоро- да, присоединенный к атому С-1, окажется на расстоянии менее 3 А от атома С-4 никотинамидпого кольца. При таком способе связывания реакция дегидрирования может протекать так, как зто было описано выше (окисление лактатдегидрогепазы), с Н(з-176 в качестве общего основного катализатора (12.17). К Сд(ЧН, С (12.17) (Сук-149) — К Н вЂ” С вЂ” Π— Н 1 О- -0 'Р Г~ .
- .О О. Переходное состояние при атаке тиоэфира ортофосфатом может стабилизироваться за счет образования водородных свя- зей между атакующим фосфатом и гидроксильными группами остатков 8ег-148, Тпг-150 и гидроксилом при С-2-атоме субстра- та, а также между атомами азота амидных групп Суз-149 и Тпг-150. Наличие специфического центра связывания фосфата объясняет тот факт, что тиоэфир фосфорилируется быстрее, нежели гидролизуется. Атом серы полуацеталя находится до.
статочно близко к С-атому никотинамидного кольца 1чАР+, что- бы поляризоваться под действием его положительного заряда. Возможно, с этим связана активация реакции переноса ацнла при связывании 5[АР+. б. Характер симметрии фермента и кооперативность при связывании лигандов Единого мнения о характере симметрии дегидрогеназы, кооперативности при связывании лигандов, а также о том, обладают ли реакционной способностью все активные центры или половина их, не существует [61 — 68[. Связывание 5[АР+ с ферментом является четко выраженным кооперативным процессом; при связывании 5[АР~ с ферментом из мышц кролика и бактериальным ферментом обнаруживается сильная отрицательная кооперативность [61, 65[, хотя при некоторых температурах ГЛАВА М 5.
Обгцие замечания относительно дегидрогеназ Структурные исследования позволили дать ясное и вполне разумное с химической точки зрения описание стереохимических и каталитических условий протекания реакции переноса гидридиона, В трех из рассмотренных примеров присутствует кислотно- основный катализатор, который образует водородную связь с карбонильной или спиртовой группой субстрата, способствует его правильной ориентации и стабилизирует переходное состояние [схема [12.18)], н»» В' Н (12.18) 1ЧАРН ПС 11 ХАР'---Н НАР' Н присоединение КАР+ к дегидрогепазе дрожжей характеризуется положительной кооперативностью [69].
С другой стороны, присоединение глицеральдегид-3-фосфата ко всем четырем субъединицам происходит независимо [68]. Наличие реакционной способности у половины активных центров установлено только в случае искусственных субстратов; например, 1,3-дифосфоглицерат ацилирует все четыре реакционноспособных остатка цистеина с одной и той же константой скорости [55, 63, 65, 68]. На основании данных ряда кинетических работ и результатов исследования связывания было высказано предположение, что эта дегидрогеназа существует в виде «димера димеров», состоящего из двух пар структурно различающихся субъединиц [67, 70]. Анализ карты электронной плотности кристаллического голофермента из омара, полученной при высоком разрешении, подтверждает эту точку зрения [57], однако более поздние исследования бактериального фермента четко показывают, что все четыре субъединицы структурно идентичны и данный фермент имеет симметрию 222 [58].
Бактериальный апофермент обладает такой же симметрией, хотя исследования проводились только при низком разрешении [58]. Сравнительный анализ свойств бактериальных апо- и голоферментов показывает, что связывание 1чАР+ вызываетсушественноесмешение домена, на котором связывается кофермент, и это приводит к уменьшению объема молекулы. Структурные предпосылки отрицательной кооперативности пока не выявлены. стРуктуРА и мехАнизм действия отдельных ФеРментов Зб! Аналогичная ситуация имеет место и в случае алкогольдегидрогеназы печени, где роль ВН" в стабилизации переходного состояния и ориентации субстрата играет либо присоединенная к цинку молекула воды, либо сам ион Уп'~. Следствием направленности образующейся водородной связи является то, что спирт присоединяется предпочтигельно к оснбвной форме катализатора (В), тогда как альдегид к кислой (ВН+).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
