Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 66
Текст из файла (страница 66)
Однако ближайшая к Суз-25 карбоксильная группа (-Азр-158) находится от этого остатка на расстоянии 7,5 А [92), т. е. слишком далеко, чтобы выступать в роли кислотно-оснбвного катализатора, в отличие от благоприятно расположенного имидазольного кольца Н!з-159. Низкое значение рК, гистидина связано в основном с тем, что этот остаток частично погружен в гидрофобную область белка. Системы, эквивалентной системе с переносом заряда, у сериновых протеаз нет; имидазольное кольцо Н!з-159 не взаимодействует с погруженной в белковую молекулу карбоксильной ~руппой.
Природу стереоспецифичности папаина помогает понять построение моделей [105). Проведенные исследования показали, что О-аминокислоты не могут поместиться в подцентрах из-за стерических затруднений, возникающих при их контактированин с ферментом. Папани не является экзопептидазой, поскольку свободная карбоксильная группа субстрата должна находиться на расстоянии 3 — 4 А от карбоксильной группы Азр-158 из-за электростатического отталкивания. Кроме того, указанные исследования позволили предположить наличие механизма деформации.
В фермент-субстратном комплексе уходящая группа субстрата, по-видимому, подвергается «давлению» со стороны а-СНг-группы Н!з-159, однако при образовании тетраэдрического промежуточного соединения это давление ослабляется. В пользу указанного предположения говорит тот факт, что аналоги субстратов, у которых уходяшая группа заменена небольшой по размерам группой, связываются значительно прочнее аналогов с более крупными остатками [92, !05). Специфичность подцентра Я, к большим по размеру гидрофобным остаткам проявляется в возрастании й„ь а не в увеличении прочности связывания. Лоу и Ютавонг [!05) предположили, что связывание подцентром Я, такого остатка, как фенилаланин, приводит к некоторому увеличению размеров расщелины и к еще большей деформации активного центра [105).
Раздвижение стенок расщелины было впоследствии обнаружено при исследовании кристаллической структуры фермента, ингибированного хлорметилкето-производным Х-бензилоксикарбонил-!.-фенилаланин-!.- аланина [104). Использование этого соединения указывает на наличие в ферменте центра связывания карбонильного кислорода расщепляемой пептндной связи. В этот центр, как и в случае сериновых протеаз, входит ХН.группа полипептидного остова, принадлежащая Суз-25; другая водородная связь образуется с участием ННмгруппы О!п-19. ГЛАВА 13 376 Механизм действия папаина как кислотно-оснбвного катализатора точно не известен.
Деацилирование ацилфермента, несомненно, сопровождается катализируемой по механизму общего оснбвного катализа атакой имидазольного кольца Н1з-!95 молекулой воды, но роль гистидина в реакции ацилирования до конца не ясна [106, 107). Установлено, что в простых химических системах пара основание  — тиол КЯН участвует в реакциях в виде йЯ- и ВН+. Случаи катализа атаки тиола по механизму общего оснбвного катализа не обнаружены. Однако не известно, чтобы вынужденная близость общего основания влияла на реакционную способность тиола (!06).
Лимитирующей стадией гидролиза амидов и анилидов, повидимому, является катализируемый по механизму общего кислотного катализа распад тетраэдрического промежуточного соединения (108, 109). В пользу этого свидетельствуют следующие данные; а) субстраты, содержащие более оснбвные анилины (р = — 1,04), характеризуются более высокими значениями й„1 и й„1/Км [108); зто означает, что атом азота в субстрате протонируется в переходном состоянии (чем сильнее основание, тем легче протонирование) и б) й .1)Км для гидролиза бензоил-) -аргининамида в случае субстрата, содержащего в уходящей группе изотоп "Х, на 2,4 та выше, чем для субстрата, содержащего изотоп 1з1); отношение /г н1й к, равное 1,024, близко к значению, ожидаемому для случая практически полного расщепления связи С вЂ” 1) [109), (Примечание: то, что лимитирующей стадией является распад промежуточного соединения, не означает, что это соединение накапливается; просто оно быстрее превращается в исходные соединения, чем в продукты.) .О Суз-25) — Б — С, / %Ну К Н (12.24) 1НК-159) — ( ~) 3.
Карбоксипептидазы [110 †1) Панкреатическая карбоксипептидаза А представляет собой металлофермент с мол. весом 34472, содержащий один атом цинка, который связан с единственной полипептидной цепью, стРуктуРА и механизм действия отдельных ФеРментов кп образованной 307 аминокислотными остатками [113). Карбоксипептидаза А является экзопептидазой и отшепляет аминокислоты от С-конца полипептидных субстратов; она специфична к большим по размеру гидрофобным аминокислотам типа фенилаланина. Очень близкая ей карбоксипептидаза В (гл. 1, равд.
В.З) специфически отшепляет остатки лизина и аргинина. В структурном отношении эти два фермента почти одинаковы, за исключением того, что в В-форме имеется остаток аспартата, который связывает положительно заряженную боковую цепь субстрата [114). Приведенный ниже материал относится к карбоксипептидазе А, однако все сказанное справедливо для обеих форм фермента. а. Структура антивного центра карбоксипептидазы А Кристаллическая структура фермента была установлена с разрешением 2,0 А [116).
Активный центр представляет собой небольшую выемку на поверхности фермента, которая ведет к глубокому карману, образованному алифатическими и полярными боковыми цепями и участками полипептидной цепи и ф Сна Н1в-196. НС-СС: ... д -г45 СМ-72 — Еог+ МН 1 Н в-Вэ 'О [ ' НО-!Туг-249) С !С1о-270)-Соа СНг / Неон"Мнг Рнс. 12.11.
Непродуктнаный комплекс днпептнда н карбокснпептндазы А. !С любезного разрешения 11рзсошь %. Н.) предназначенному для связывания С-концевой аминокислоты. Лигандами иона цинка, играюшего важную роль в катализе, являются оснбвные боковые цепи остатков О1п-72, Н!з-196 и Н!з-69. Приблизительно у 20% молекул фермента четвертым лнгандом является атом кислорода фенольной группы Туг-248 [116).
Боковая цепь этого остатка обладает высокой конформационной подвижностью, что послужило источником разногласий в вопросе о сходстве структуры этого фермента в растворе и в кристалле и привело к бурным дискуссиям [116, 117). Боковая цепь, содержашая фенольную группу, может поворачиваться вокруг своей С вЂ” Сз-связи, и примерно 80% электронной плотности этой группы локализовано на той части молекулы, которая ГЛАВА 12 направлена в раствор [1!6]. В карбоксипептидазе В зтот остаток настолько подвижен, что его положение в кристаллической структуре определить не удается [114]. Модель связывания субстратов карбоксипептидазой А была построена исходя из данных о структуре комплекса фермента с гладил-) -тирозином, установленной разностным Фурье-методом с разрещенпем 2 А (рис.
!2.11) [110, 115]. Дипептиды гидроли- Снз Нм-196 НС вЂ” СО2" ° Агв-!45 81 24 О1о-72 — Еп НН. ВН ' О [ НО-!Туг-24ГЛ 'С [ !Ою-270)-СО2 НС Н 81 я С» 1 НСН 82 2 нн С=О" .Агв-7! я з~с аз нн' Н4 С=О Сй 8 4 ннз Рис. !2.)2. Предполагаемоесвязывание полипептидного субстрата с карбоксипептидазой А с образованием продуктивного комплекса. (С любезного разрешения Ьбрзсошь )У. 74.) зуются очень медленно и связываются в основном непродуктивно. Предполагается, что низкая скорость гидролиза обусловлена тем, что свободная аминогруппа субстрата связывается с карбоксильной группой 61п-17 через молекулу воды.
Это не позволяет карбоксильной группе играть роль общего основания или нуклеофила в реакции гидролиза (см. ниже). Для построения модели продуктивного связывания используются также следующие особенности рассматриваемого комплекса: боковая ароматическая цепь связывается в связывающем кармане; С-концевой карбоксилат-ион образует ионную связь с АГЮ-145; карбоксильньгй кислород расщепляемой связи становится четвертым лигандом иона цинка; фенольный кислород Туг-148 находится на расстоянии примерно 3 А от расщепляемой связи; боковая цепь повернута на -120' относительно положения, занимаемого ею в свободном ферменте. Используя все эти данные, можно построить схему расположения полипептидной цепи, представленную на рис.
12.12. СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 379 б. Механизм реакции Механизм действия карбоксипептидазы изучен не столь хорошо, как для сериновых и тиоловых протеаз. Роль всех каталитических групп однозначно не установлена. Ион цинка, по всей вероятности, играет роль электрофильного катализатора, поляризуя карбонильную группу и стабилизируя образующийся на атоме кислорода отрицательный заряд (гл. 2, равд. Б.7) [118].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
