Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 69
Текст из файла (страница 69)
Молекула ДНК рибонуклеазой не гидролизуется, поскольку у нее отсутствует 2'-гидроксильная группа. Фермент высокоспецифичен по отношению к основанию, находящемуся на 3'-конце: это основание должно быть пиримидином— урацилом или цитозином. Рибонуклеаза имеет мол. вес 13 680 и образована единственной полипептидной цепью, содержащей !24 аминокислотных остатка [166, 167[. Связь между А!а-20 н Бег-2! может расщепляться субтилизином. Интересно отметить, что при этом пептид остается связанным с остальной частью мочекулы с помощью нековалентных связей. Модифипированный белок, названный рибонуклеазой 8, и нативный белок, называемый сейчас рибонуклеазой А, обладают одинаковой каталитической активностью. Благодаря своим небольшим размерам, простоте выделения и стабильности рибонуклеаза очень удобна для физических и химических исследований.
Она была первым ферменгом, для которого удалось определить аминокислотную последовательность [166[. Кристаллическая структура обеих форм фермента была установлена с разрешением 2,0 А [168, 169[. Поскольку каталитическая активность рибонуклеазы зависит от состояния ионизации двух остатков гистидина, фермент всесторонне исследовался с помощью ЯМР— очень ценного метода для анализа свойств имидазольного кольца гистидина (гл. 5, разд.
Ж.2.а). стРРЕТРРА н механизм денстВня Отдвльных ФеРментОВ ззв (Н(з-119) Н!ч' 3ЮН ! О! -О'.РФ (Н!з-12) о' н'.н~:н ~н (12.37) ( Н)з-119) Н /=~ : о о Н~ 1Ч: ~Н вЂ” О ' Ф~ (Н1з-12) Г Я5 Н вЂ” '1н(..'1Ч Н (12,38) На стадии циклизации Н!з-!2выступаетв роли общегооснбвного катализатора, а Н!з-119 — в роли общей кислоты, которая протонирует уходящую группу. На стадии гидролиза Н!з-12 и Н!з-!19 меняются ролями; Н!з-1!9 активирует атаку воды по механизму общего оснбвного катализа, а Н!з-12 является кислотным катализатором, протонирующим уходяшую группу.
Такая обратимость вполне логична. Реакция (12.38) по существу является реакцией, обратной (!2.37), за исключением того, что КОН заменено на НОН. Исходя из принципа детального равно- Химический механизм действия рибонуклеазы в том виде, в каком его себе сейчас представляют, был построен из общих соображений еще до установления кристаллической структуры фермента )170). Известно, что график зависимости активности фермента от рН представляет собой колоколообразную кривую с максимумом при рН - 7. рН-зависимость Й.,ЕКм показывает, что скорость гидролиза зависит от состояния ионизации в свободном ферменте основания с рК, = 5,22 и кислоты с рК, = 6,78, в то время как из рН-зависимости й„~ следует, что в ферментсубстратном комплексе эти значения рК, изменяются до 6„3 и 8,1.
Было высказано предположение, что реакция катализируется по механизму общего кислотно-оснбвного катализа с участием двух остатков гистидина, как выяснилось позднее,— Н!з-12 и Н(з.! 19: ГЛАВА М весия, можно ожидать, что группа, выступающая в прямой реакции в роли общей кислоты, в обратной реакции будет играть роль общего основания. 1. Структура фермента и фермент-субстратного комплекса 1164, 171] В рибонуклеазе имеется четко выраженная расщелина для связывания субстрата.
В этой расщелине располагаются Н1з-!2, Н!з-! !9 и боковые цепи остатков 1.уз-7, 1.уз-41 и 1.уз-66. Структура фермент-субстратного комплекса на стадии циклизации была построена исходя из данных кристаллографических исследований структуры комплекса фермента с аналогом субстрата 1)рсА (12.39), представляющим собой фосфонатный аналог 1)рА. !ч Н НО 0 <Х,~' О ОН Р О СН,С НО ОН Это очень близкий аналог, отличающийся от субстрата только тем, что атом кислорода замещен в нем -СНз-группой, так что структура его комплекса с рибонуклеазой близка к структуре продуктивного фермент-субстратного комплекса. Установлено, что Н!з-119 располагается на расстоянии длины водородной связи от уходящей группы, а Н!з-!2 — на расстоянии длины водородной связи от 2сОН-группы рибозы пиримидина. Ни одна из боковых цепей лизина не вступает в прямой контакт с субстратом, однако они, по-видимому, имеют важное значение для СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДВНСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 391 катализа, поскольку а) при их ацетилировании фермент теряет свою активность и б) остатки лизина находятся в положениях 7, 41 и 66 во всех 20 (или около того) рибонуклеазах этого класса, лля которых установлена аминокислотная последовательность [172].
Возможно, положительные заряды этих боковых цепей стабилизируют промежуточное соединение, содержащее пятивалентный атом фосфора, которое образуется, когда гидроксильная группа атакует фосфат. Значения рК, для Н)з-12 и Н!В-119, измеренные с помощью ЯМР при 40 С, оказались равными 5,8 и 6,2 соответственно [173]. При физиологическом рН значительная часть гистидиновых остатков находится в таком состоянии ионизации, при котором возможен общий кислотно- основный катализ [схема (12.37)]. Показательным примером специфичности по принципу замка и ключа может служить связывание пиримидина с активным центром [171]. Водородные связи с тидроксильными группами Зег-123 и Тпг-45 и 5)Н-группой, принадлежащей Т)гг-45, могут образовывать как урацил, так и цитозин [схема (12.40)].
Связывание производных аденозина, имеющих ббльший размер, приводит к смещению фосфата относительно гистидиновых остатков. о н — м (Тьг-45) ь! ('ДВ.45) Н' 'Н 'Н вЂ” О у" ГО~ (и г)гз) Н (йы-123) О (1г.40) 2. Стереохимия реакции замещения Нуклеофильное замещение у атома фосфора в реакции этого типа протекает как реакция присоединения †отщеплен, в которой образуется промежуточное соединение, содержащее пятивалентный атом фосфора, Упомянутая реакция может осуществляться двумя путями: по механизму (12.41), когда атакующий нуклеофил присоединяется со стороны, противоположной уходящей группе (1п-1!не тесман)зш), или по механизму (12.42), когда нуклеофил подходит со стороны уходящей группы ГЛАВА 12 (ад]асеп! тес)1ап(згп) [174, 175].
В последнем случае реакция имеет еше одну стадию. О о КΠ— Р— ОК' — + КΠ— Р. +КО (12.41) но' ь ! 'Он О О о КО ' Р— ОК' НО ] 0 Р— ОК' Но'О:СОК -И ер-ОК О О" (12.42) 3кватоРиальное ОК' Аксиальнос ОК' о.+ о~:-- ! .-Р— — - ОК Экваториальное ОН НΠР— ОК /'1 -о~ (()- йссиал (12.43) Исследование фермент-субстратного комплекса позволило высказать предположение о наличии механизма (!2.41), которое получило подтверждение в ходе весьма элегантных химических экспериментов с использованием оптически активного субстрата уридин-2'-3'-циклофосфотиоата 1176 — ! 78]; НО Расщепляемая — связь (12.44) йо механизма (1241), 7 — Атака ао механизме (12 42) Б 0 Для тригонального бипирамидальиого атома фосфора должен наблюдаться поворот заместителей, что обусловлено перемешением уходяшей группы в аксиальное положение ]схема (12.43)]. Эта перегруппировка является следствием детального равновесия: нуклеофил атакует по аксиальному положению и, следовательно, уходяшая группа должна покинуть это положение (поскольку в ходе обратной реакции она должна атаковать по аксиальному положению).
ствхктлх и механизм деиствия отдельных еевментов звз Это соединение было получено в кристаллическом виде, а его структура и абсолютная стереохимическая конфигурация установлена с помогцью рентгеноструктурного анализа. При инкубации с рибонуклеазой в смеси метанол/вода образовывался метиловый эфир по механизму, обратному схеме (12.3г7). Это соединение было также закристаллизовано, а его абсолютная стереохимическая конфигурация установлена методом рентгено. структурного анализа (см. схему (!245)).
НО НО !12.45) О О Г Мео: -".Р, Н Б о О ОН Р, МеО О- 8 Метиловый эфир образуется по механизму (12,41). Прн инкубации его в водном растворе с рибонуклеазой образуется исходный циклофосфотиоат (12.44), что согласуется с принципом детального равновесия, поскольку прямая и обратная реакции должны протекать через одно и то же переходное состояние. Но зто прямо показывает, что стадия циклизации сопровождается атакой по механизму (12.4!): атака гидроксила рибозы по механизму (12.42) при циклизации метилового эфира в реакции (12.45) должна была бы дать энантиомер циклофосфотиоата. НΠΠΠ— Н / Р МеО , ь Ащакадо мехаггишгг (12,41) ΠΠ— Н (1246) Р О 1 ОМе Я Агпака ла лгкханггаагл ~12.42) ГЛАВА М Г.
Стафилококковая нуклеаза [179, 180] Стафилококковая нуклеаза является фосфодизстеразой, расщепляющей ДНК и РНК с образованием 3'-фосфомононуклеозидов. О 11 Н'Π— Р-О— 1 О НΠ— + В'ОРО~ + ОзРО (ОН) (12.47) Фермент имеет мол. вес 16 900 и образован единственной полипептидной цепью, содержащей 149 аминокислотных остатков. Структура стафилококковой нуклеазы и его комплекса с тимидин-3',5'-дифосфатом была установлена с разрешением 2,0 А ]181, !82], и, несмотря на это, механизм действия фермента не известен.
Вспомнив об успехах, достигнутых при исследовании рибонуклеазы, и имея в виду все вышесказанное о стафилококковой нуклеазе, можно сделать вывод, что определение структуры фермента не означает, что мы автоматически устанавливаем механизм его действия. И тем не менее данные о кристаллической структуре послужили основой при выяснении механизма действия рассматриваемого фермента. 5'-фосфатная группа тимидин-3',5'-дифосфата в комплексе фермента с ингибитором занимает, по-видимому, центр связывания фосфата днэфирного субстрата.
Эта группа связана водородными связями с положительно заряженными боковыми цепями Агя-35 и Агя-87, что облегчает атаку нуклеофилом. Однако вблизи расщепляемой связи не обнаружено никаких кислотнооснбвных боковых цепей, хотя на расстоянии 5 А от фосфатной группы находится ион кальция, связанный с карбоксилатными группами Азр-21, Азр-40 и О1п-43. Известно, что ионы кальция имеют важное значение для активности фермента. Возможно, в реакции принимают участие связанные с металлом нуклеофильные гидроксил-ионы ]схема (12.48)] [183, 184], ствэктэгх и маханиям двнствия отдельных эвгмзнтов (Агй-зб) )чН / Н (Агй-87) ~-. ~н н~ l Н!Чн н]ЧН К' — Π— Р— О ~О СН' О 1! ОН вЂ” "Са (И.48) Д.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
