Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 70
Текст из файла (страница 70)
Лизоцим [187 — 189] Лизоцим яичного белка — это небольшой фермент с мол. весом 14500, состоящий из 129 аминокислотных остатков. О лизоциме говорилось в конце гл. 1; отмечалось, что пионерские работы по установлению кристаллической структуры этого фермента стимулировали исследования ферментов в растворе. Механизм действия лизоцима был построен исходя из данных о структуре активного центра с привлечением идей физической органической химии [190, 19!]. Механизм основан на следующих положениях. Молекула лизоцнма имеет шесть подцентров для связывания глюкопиранозных колец субстрата — А, В, С, О, Е и Р; расщепляемая связь располагаетсямеждуподцентрами 1) и Е поблизости от карбоксильных групп О!п-35 и Азр-52; это позволяет предположить, что реакция протекает через образование промежуточного карбоний-иона (точнее карбоксоний-иона), который стабилизируется ионизированной карбоксильной группой Это предположение подтверждается в какой-то мере тем фактом, что между ионом кальция и фосфатной группой имеется некоторая электронная плотность, как видно на карте кристаллической структуры; кроме того, рН-оптимум ферментативной активности весьма высок (график рН-зависимости й„г/Км представляет собой колоколообразную кривую, положение максимума которой определяется значениями рК, 8,4 и 9,2) [185].
Все приведенные соображения носят сугубо предположительный характер. Необходимо, кроме того, обратить внимание на следующее обстоятельство: с комплексом между ферментом и ингибитором связано два иона кальция [186], но в кристаллической структуре виден только один. остатка Азр-52. Высвобождение спирта катализируется по механизму общего кислотного катализа неионизированной карбоксильной группой О)п-35.
Кроме того, как обсуждалось в гл. 10 (равд. А.5.б и В.5.в), при связывании с подцентром Р кольцо сахара принимает свойственную карбоний-иону конформацию «софы»; для небольших полисахаридов деформации на участке Р не происходит вследствие связывания их с центрами АВС. Рассмотрим, каким образом все эти положения (за исключением, пожалуй, роли деформации при связывании с подцентром Р) были проверены экспериментально. (Конформация глюкопиранозного кольца, связанного с подцентром Р, вначале была названа конформацией «полукресла», однако точнее называть ее «софой» (192].) СН,ОН О КО (О!и-35) НО ННА« О«С вЂ” (А«Р-52) О,С вЂ” (О!я-35) НОК' КО О," НО О,С вЂ” (Азр-52) )ЧНАс (12.4») 1.
Карбоний-ион Механизм с участием карбоний-иона реализуетсяпутемпрямой атаки субстрата водой нли путем нуклеофильной атаки остатком Азр-52 углеродного атома С-1 с образованием промежуточного соединения, которое по своей природе является эфиром. Простая реакция замещения исключается, поскольку протекает с сохранением конфигурации (гл. 7, равд. В.З) [193— 1951. Образование карбоний-иона, т.
е. выполнение механизма Вя1, подтверждается данными о вторичных изотопных эффектах в опытах с использованием субстратов, меченных в положении С-! дейтерием или трнтием (196, 197). Так, например, йн/йо для соединений, представленных на схеме (12.50), составляет 1,!1, в то время как для реакции с образованием нарбоний-иона эта СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ зэт величина равна 1,14, а для реакции бимолекулярногозамещения (ВИ2) в простых химических моделях — 1,03.
СН,ОН СН,ОН ОРИ ОРИ Н Н Н ОН ОН (12.50) 2. Электростатический и общий кислотный катализ рН-зависимость Й„~1КИ показывает, что скорость реакции, катализируемой лизоцимом, определяется состоянием ионизации кислоты с РК, 6 и основания с рК, — 4 всвободном ферменте [198]. Остаток Азр-52 можно специфически блокировать посредством этерификации его триэтоксонийфторборатом (реакция, протекающая лишь при наличии ионизированной карбоксильной группы). Различие в кривых титрования для модифицированного и нативного белка показывает, что значение рК, Азр-52 равно 4,5, тогда как для О1п-35 оно составляет 5,9 1199]. Таким образом," скорость реакции зависит от состояния ионизации этих двух остатков в соответствии с рассмотренным выше механизмом действия лизоцима.
Результаты, полученныепри исследованииобратной реакции, указывают на наличие механизма общего кислотного катализа с участием О)п-35. Установлено, что скорость реакции спиртов с карбоний-ионом фактически не зависит от их рК,. Этот факт позволяет предположить, что имеет место катализируемая по механизму общего оснбвного катализа атака карбоний-иона спиртом, и, следовательно, согласно принципу детального равновесия, высвобождение алкоголят-иона из гликозида ускоряется по механизму общего кислотного катализа (200].
Описывая впервые механизм действия лизоцима, Вернон ]!91] подчеркивал, что наиболее важным фактором катализа является электростатическая стабилизация карбоксоний-иона остатком Азр-52. Проведенные недавно теоретические исследо. вания, в которых впервые принималась во внимание диэлектрическая постоянная белка, свидетельствуют о том, что в результате электростатической стабилизации энергия активации для стадии химического превращения, характеризующейся константой й„ь уменьшается на 37,6 кДж моль — ' (9 ккал моль-') ]201]. Этот вывод получил экспериментальное подтверждение глава гт Такое сильное уменьшение энергии активации показывает, что химическое превращение карбоксильной группы Азр-52 в — СНтОН-группу приводит к потере ферментативной активности [202).
3. Энергии связывания с подцентрами Первоначально предполагалось, что нековалентные взаимодействия между ферментом и сахарным кольцом на подцентре Р приводят к тому, что сахар переходит в конформацию «софы», свойственную карбоний-иону.
Предпринимались попытки оценить энергию связывания с этим подцентром путем выделения соответствующей составляющей из суммарной энергии связывания, полученной из кинетических данных и экспериментов по связыванию [!87, !89). Некоторые результаты этих исследований представлены в табл. !2.3. Хотя приведенные значения не Таблица 122 Энергия свяаывання различных остатков с подцентрамн лнвоцнма яичного белка Энергия свивмваиия Свяамваемма остаток а! Полцеитр кдм моль ккал.моль А в С Гг в> МАО М-вцетилглвкоавмии, аая кислота. МАМ М-вцетвлмурам~ отличаются высокой точностью, ясно, что взаимодействие!т!АМ с подцентром 0 сопровождается их взаимным отталкиванием.
Кроме того, поскольку установлено, что (!ь[АО)в связывается примерно одинаково с подцентрами А, В, С и А, В, С, О, никакого выигрыша в энергии при связывании !т!АО с подцентром О нет [203). Место связывания небольших субстратов было определено по их взаимодействию со специфическими соединениями-зондами, например с красителем бибрихским алым [204) НАСг МАМ МА0 МАМ ГтА0 — 8 -12 — 1б — 20 +12 Π— 18 -8 — 2 — 8 -4 -Б +3 О 4 -2 СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ ззз и ионом лантанида [203], которые связывались в расщелине; было показано, что указанные субстраты связываются в основном непродуктивно.
На первый взгляд это служит веским доводом в пользу механизма деформации. Однако Левитт [205], пересмотрев эти данные (гл. 1О, равд. В.4.в) и проделав соответствующие расчеты, пришел к выводу, что вероятность деформации сахарного кольца при связывании с подцентром Р очень мала [201, 205]. Кроме того, было показано, что аналоги переходного состояния, имеющие химически модифицированное сахарное кольцо, структурно аналогичное карбоний-иону, связываются не более чем в !00 раз прочнее субстратов, у которых это кольцо не модифицировано (гл.
1О, равд. А.5) [203, 206]. Далее, предполагается, что слабое связывание сахарного кольца с подцентром О обусловлено вытеснением этим кольцом двух молекул воды, связанных с карбоксильной группой Азр-52. Следовательно, связывание с подцентром является скорее «электростатическим», чем механическим. (В любом случае, как подчеркивалось в гл. 10, более прочное связывание переходного состояния не означает, что связанный субстрат деформирован.) Данные, полученные в результате рентгеноструктурных исследований лизоцима и его комплексов с ингибнторами, не только выдержали испытание временем, но и получили четкое подтверждение при исследовании в растворах (но в этом случае основное внимание уделялось электростатической компоненте механизма напряжения, а не компоненте, обусловленной деформацией).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
