Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 71
Текст из файла (страница 71)
Наконец, следует отметить, что, как установлено, связывание небольших субстратов является двухстадийным процессом, сопровождающимся изомеризацией фермент-субстратного комплекса [207, 208]. В чем состоит это так называемое конформационное изменение. и как соотносится с описанной выше схемой — неясно; можно предположить, что оно связано с небольшими структурными изменениями, наблюдающимися при связывании (й)АО)» в кристаллическом ферменте. Е. Карбоаигидраза [209, 210] Карбоангидраза катализирует гидратацию двуокиси углерода и дегидратацию бикарбоната: СО|+ НвО ч=:е НСО, +и+. (12.51) Кристаллическая структура изоферментов В и С человека была установлена с высоким разрешением [211, 2!2]. Обе формы являются металлоферментами, содержащими один моль цинка, прочно связанного с единственной полипептидной цепью с мол.
ГЛАВА 12 весом 29 000. Полипептидная цепь более активной С-формы состоит из 259 аминокислотных остатков — на один меньше, чем у В-формы [213, 214]. Аминокнслотные последовательности этих двух изоферментов совпадают на 60тю а их третичные структуры очень сходны. Лигандами иона Еп'~ являются имидазольные кольца трех остатков гистидина, расположенных на дне полости активного центра на расстоянии около 12 А от поверхности молекулы фермента.
Четвертым лигандом служит, по-видимому, молекула воды или гидроксил-ион (в зависимости от рН) [211, 212]. Изофермент С является чрезвычайно эффективным катализатором. Для реакции гидратации й.м равна 10~с-', а Км для СОА — 8,3 мМ, в то время как для реакции дегидратации й,м = 6 10" с-', а Км для НСО, равна 32 мМ [215]. Каталитическая активность фермента определяется состоянием ионизации группы с рК,=7 в свободном ферменте [215]. Реакция гидратации зависит от доли этих групп, находящихся в оснбвной форме, а реакция дегидратации — от доли этих же групп, находящихся в кислой форме. Число оборотов для указанных реакций 'значительно выше констант скорости переноса протонов между водой и группой с рК, = 7 (приблизительно 2.10' с-', табл, 4.2).
В нефизиологических реакциях эти ферменты катализируют также гидратацию альдегидов и гидролиз эфиров. Предметом исследований в данной области являются в последнее время три вопроса: а) что представляет собой ионизирующаяся группа с рК, = 7, от которой зависит активность фермента? б) какова природа субстрата, связываемого в реакции дегидратации [НСО,, или Н~СОз)? в) совместимы ли высокие числа оборотов со скоростями переноса протона? В рамках классического механизма считается, что при высоком рН связанный с цинком нуклеофильный гидроксил-ион образуется за счет связывания с этим атомом молекулы воды с рК,=7 [2!О, 216].
Известно, что связанный с цинком гидроксил-ион является нуклеофилом и ионизируется в этой области (гл. 2, равд. Б.7.6). Было высказано множество других предположений на этот счет [217 — 219], по единственными группами в активном центре, которые могут иметь указанный рК„являются гистидины. Однако исследование процесса ионизации остатков гистидина с помощью ЯМР выявило несоответствие между активностью фермента и состоянием их ионизации [220]. К тому же результаты измерений ядерных квадрупольных взаимодействий в ферменте, где цинк замешен на кадмий, указывают на ионизацию связанной с металлом молекулы воды с таким же рК„какое было найдено из рН-зависнмости активности фермента [221].
стгхктхгх и мвххнизм даиствия отдвльных фвнмвнтов 40! Вполне разумным с химической точки зрения является следующий механизм: ! г' Хв О 1! О ~С ! [! Н О 1 1 / Уп' О с Н вЂ” О и 1[ — ~ НСОТ (12. 52) 1 г хп2+ 7 Н,О О 1У Н Н Любой механизм, в котором предполагается, что в роли субстрата в реакции выступает НСО~, требует, чтобы на каком-то этапе от фермента отщепился протон и высвободился всреду.
На схеме (12.52) этот процесс происходит на стадии 1Ч- 1. В растворе, не обладающем необходимой буферной емкостью, скорость переноса протона слишком мала, чтобы регенерировать свободный фермент. Так, например, из данных табл. 4.2 видно, что константа скорости переноса протона от основания с рК, = = 7 на молекулу воды равна 2,5.10' с-', а на гидроксил-ион при концентрации 10-тМ и рН 7 — 2,3 10'с — ', эти величины значительно ниже числа оборотов 5 10' с-' при этом же рН.
Данное противоречие нельзя разрешить, предположив, что на стадии Н1- 1Ч ион цинка связывается не с молекулой воды, а с ОН--группой. Максимальное значение константы скорости второго порядка равно — 10'о — !О" М-'с-' (гл. 4, часть 2), что при концентрации гидроксил-иона !О-' М дает для этой стадии при рН 7 предельное значение константы скорости !О' — !О' с-'. Аналогичные расчеты показывают, что недиссоциированная кислота НзСОэ тоже не может служить субстратом в реакции дегидратации, поскольку ее концентрация при рН 7 низка по сравнению с концентрацией НСО, [216, 222[. Если бы Н~СОз служила субстратом, то ни поглощения протона, ни высвобождения его в среду не происходило бы.
Однако простой расчет показывает, что такие значения констант скорости переноса можно объяснить даже теми низкими концентрациями буферов, которые обычно используются (см. табл. 4.2) [216, 2231, 402 ГЛАВА М Недавно это положение было проверено в ходе экспериментов с применением растворов, не обладаюших буферной емкостью: скорость реакции дегидратации оказалась аномально низкой. Добавление 10 мМ буфера приводит к восстановлению максимальной скорости [224, 225). Дополнение, В настояшее время установлена кристаллическая структура комплекса карбоангидразы В человека с конкуентным ингибитором — имидазолом [Каппап К. К., Ре!е1 М., ГЫЬогд К., СЫ-Ргездепег Н., (очдгеп Я., РЕВЯ 1е!!з., 73, 115 (1977)).
Этот находяшийся в гидрофобном кармане имидазол через атом азота связан координационной связью непосредственно с ионом цинка. Наиболее интересно, по-видимому, то, что он является пятым лигандом цинка и не вытесняет связанную с ним молекулу воды или ОН--группу. По аналогии с этим предполагается, что атом кислорода двуокиси углерода также непосредственно присоединяется к атому цинка и не вытесняет воду. Таким образом, цинк не только ориентирует молекулу СО, и поляризует ее, но и поставляет связанную с ним нуклеофильную молекулу воды: Ф~ О (О!и-105) — С О " Н (ТЬг-199) О (12.52а) Увеличение координационного числа цинка до пяти при связывании субстрата аналогично предполагаемому увеличению координационного числа для алкогольдегидрогеназы из печени лошади [схема (12.4)) [15).
Авторы этой работы указывали,что связанная молекула воды образует водородную связь с гидроксильной группой остатка ТЬг-!99, который в свою очередь связан водородной связью с карбоксильной группой 6!п-106. Это заставляет взглянуть на проблему идентификации группы, ионизируюшейся с рК, = 7, с другой стороны. Возможно, этой группой является карбоксильная группа О1п-!06, рК, которой сушественно возрастает при изменении окружения, а не связанная с цинком молекула воды.
Если это так, то нуклеофилом СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 4ОЗ является не гидроксил-ион, как это изображено на схеме (12.52,а), а неионизированная молекула воды, активируемая остатком б!ц-106 по механизму общего оснбвного катализа при участии гидроксила остатка Тпг-!99. Ж.
Гликолитические ферменты Большинство гликолитических ферментов получено в кристаллическом виде, и их кристаллическая структура установлена. Современное состояние рентгеноструктурных исследований в этой области было освещено Блэйком )226). К сожалению, аминокислотная последовательность установлена только для нескольких ферментов. Два из них — лактатдегидрогеназа и глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеназа — были рассмотрены ранее, в равд. А. Здесь мы остановимся лишь на отдельных интересных вопросах, связанных с некоторыми из этих ферментов.
1. Триозофосфатизомераза (227 — 229! Триозофосфатизомераза весьма эффективно катализирует взаимопревращения 0-глицеральдегид-3-фосфата и диоксиацетонфосфата: н~ с н — с — он 1 сн,оро) сн,он с=о сн,опор (12.53) а. Структура фермент-субстратного комплекса Указанный фермент предоставляет ученым редкую возможность прямо исследовать фермент-субстратный комплекс с помощью рентгеноструктурного анализа. Катализируемая реакция представляет собой простое равновесное взаимопреврашение субстрата и продукта, причем константа равновесия реакции Кристаллическая структура фермента из мышц цыпленка была установлена с разрешением 2,5А )230 — 231).
Фермент является симметричным димером с мол. весом 53000, каждая из идентичных цепей которого содержит 247 аминокислотных остатков. Никаких указаний на наличие какой-либо кооперативности между субъединицами в процессе катализа не выявлено. ГЛАВА !а 404 ( -20)' такова, что равновесие сильно сдвинуто в сторону образования диоксиацетонфосфата. Это позволило установить кристаллическую структуру комплекса фермента с ацетонфосфатом с разрешением 6 А, воспользовавшись разностным Фурье-методом; субстрат проникал внутрь кристаллов фермента с помощью диффузии )230, 232). Удалось не только локализовать некоторые конформационные изменения в ферменте, ио и определить положение субстрата относитсльно двух кислотно-оснбвных каталитических групп фермента и выяснить механизм реакции.
Из исследований фермента в растворе известно (см. ниже), что реакция протекает через образование промежуточного соединения цис-ендиола (232, 234) с переносом протона при участии одного основания, возможно, карбоксильной группы остатка О!и-!65 [235 †2). Согласно рентгеноструктурным данным, карбоксильная группа глутаминовой кислоты располагается на одинаковом расстоянии от С-3- и С-2-атомов субстрата, что обусловливает перенос протона между ними. Установлено также, что имидазольное кольцо Н!5-95 находится на равном расстоянии от карбоксильного и гидроксильного кислорода, что также обеспечивает перенос протона от одного из этих атомов на другой.
2. Эксперименты с использованием в качестве меток дейтерия и трития и механизм действия ферментов, катализирующих кето-альдольную изомеризацию Одним из наиболее важных методов исследования механизма действия ферментов, участвующих в переносе водорода между двумя углеродными атомами, состоит в использовании изотопов водорода. Эти эксперименты с каждым годом становятся все сложнее, и, чтобы лучше в них разобраться, стоит рассмотреть их в ретроспективном плане. ' В растворе такие субстраты, как альдегид и кетон, частично гидратированы: Нг я',,он с=о+и,о и=в с и' я' 'он Прн 25'С около 55э(э дяоксиацетонфосфата и з,зе/н глицеральдегид-3-фосфата находятся в негидратированных кетоформах, которые и являются субстратами в ферментативвых реакциях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
