Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 67
Текст из файла (страница 67)
Характер рН-зависимости скорости реакции позволяет сделать вывод, что в каталитическом процессе участвует ионизированная карбоксильная группа б!и-270. График зависимости активности фермента от рН представляетсобой колоколообразнуюкривую с максимумом при рН 7,5; положение максимума определяется нонизацией оснбвной формы группы с рК.
=6 и кислой формы группы с рК. =9,1 в свободном ферменте [119, 120]. Более низкий рК. соответствует П!И-270, более высокий пока не отнесен ни к какой группе. По всей видимости, гидроксильная группа Туг-248 выступает в этой реакции в роли общей кислоты [110]. Хотя прямых данных в пользу высказанного предположения нет, данный остаток, несомненно, важен для проявления пептидазной активности. Модификация боковой цепи тирозина в результате ацетилирования или диазотирования подавляет пептидазную активность, но усиливает эстеразную активность фермента [121].
Интересно, что при замещении цинка атомом ртути, кадмия или свинца эстеразная активность не изменяется, а пептидазная подавляется [122]. Центральным моментом механизма действия карбоксипептидазы является вопрос о том, в какой роли выступает остаток Сг!п-270 в является ли он нуклеофильным катализатором, образующим смешанный ангидрид с субстратом [схема (12.25)], или представляет собой общее основание, которое активирует атаку субстрата молекулой воды [схема (12.26)] [110]. н,о ц — СОг +'ггСО)(НСН(Гг )СОг г ."гНгСН(П ) СОг + Е СОгОС(1 г — г. Š— СО, -1- ((СО, + Г(НгСН(((')СО, (12.25) 8 — СО, + Н,О+ ЦСОМНСН(Ц')СОг — » К вЂ” СО, + ПСО, + Г(НгСН(ц')СОгч (12.26) Дело в том, что прямых данных слишком мало, чтобы можно было сделать выбор между этими двумя возможностями.
Применение методов исследования быстрых реакций (включая импульсное «замораживание» реакции), в которых использовались физиологические субстраты, никогда не позволяло обнаружить промежуточный ацилфермент. Совсем недавно были описаны два эксперимента, результаты которых противоречатдруг другу. Данные опыта, в котором в качестве субстрата использовался эфирный субстрат — О-(транс-и-хлорциниамоил)-) -[)-фенил- 380 ГЛАВА Гз лактат — свидетельствовали о наличии двухстадийного механизма, включающего образование в качестве промежуточного соединения ацилфермента в ходе реакции между коричной кислотой и карбоксильной группой фермента 1123]. С О; 1 Н О вЂ” ССН,РЬ н Поскольку при нормальной температуре промежуточные соединения обнаружить не удавалось, опыты проводились при температурах до — 60'С.
За ходом реакции следили по изменению в спектре поглощения остатка коричной кислоты (аналогично тому, как это делалось в случае фурилакрилоиловой группы; гл. 7). Спектр этого соединения очень чувствителен к химическому окружению; он может измениться при образовании фермент-субстратного комплекса, ацилфермента и комплекса фермента с продуктом, и предсказать природу этих изменений не так-то просто, При смешивании субстрата с избытком фермента при повышенных температурах было установлено, что гидролиз субстрата представляет собой простой экспоненциальный процесс, Однако при низких температурах (порядка — 40'С) реакция является двухстадийной. При увеличении температуры константа скорости для второй стадии возрастает быстрее, чем для первой.
Таким образом, при низкой температуре вторая стадия является более медленной, чем первая, а при высокой — более быстрой. Было высказано предположение, что на первой стадии происходит образование ацилфермента, а на второй — его гидролиз. При нормальных температурах скорость деацилировання относительно высока, поэтому ацилфермент не накапливается; при низких же температурах скорость становится достаточно низкой для накопления этого соединения. Однако изменения в спектре поглощения циннамоильного остатка не удается так просто связать с какими-либо конкретными химическими или физическими событиями, как это было, например, в случае ц-нитрофенола, увеличение поглощения которого указывало на расщепление нитрофенилового эфира.
Не исключено, что изменения в спектре поглощения обусловлены индуцируемыми субстратом конформационными изменениями в ферменте. В связи с этим понадобились дополнительные доказательства в пользу образования ковалентного промежуточного соединения. При — 58'С, когда ацилфермент стабилен, к ферменту был добавлен СТРУКТУРА Н МЕХАНИЗМ ДЕЯСТВНЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ за1 прочно связывающийся конкурентный ингибитор 1-бензилсукцинат.
Этот ингибитор не вытеснял из фермента циннамоильный остаток, указывая на то, что последний связан ковалентно. Имеются данные, что это ковалентное промежуточное соединение является ангидридом кислоты: при частичной денатурации ацилфермента мочевиной происходит деацилирование с константой скорости, отвечающей гидролизу ангидрида кислоты. Результаты другого недавно проведенного эксперимента, в котором исследовался изотопный обмен [124], свидетельствовали против образования ацилфермента. Если гидролиз протекает по схеме (12.25) (с образованием ангидрида), то для синтеза пептида в ходе обратной реакции необходимо предварительное образование ангидрида из фермента и ОСОТ .
Следовательно, фермент должен обладать способностью катализировать обмен "О между субстратом и водой [схема (12.27)]. Однако без КС~~О1+Е-СОТ -~~ Е-СО~~~ОСК = КСО~~О Ф Е-Соу Н,'"О н,о (12.27) добавления свободной аминокислоты МНАСН()х')СО, обмена не происходит, он имеет место лишь в ее присутствии в результате синтеза пептида в ходе обратной реакции. Обмен не стимулируется аналогом указанной кислоты НОСН(Й')СОз. Все эти данные исключают возможность протекания реакции через образование ангидрида, если только не предположить, что добавляемая аминокислота (но не ее гидроксилсодержащий аналог) является активатором реакции обмена или высвобождающаяся в ходе реакции (12.27) Нз О не обменивается со средой, оставаясь связанной с ферментом.
Все сказанное выше вместе с данными о том, что метанол не может заменить воду в реакции сольватации, привели к механизму, представленному на стр. 382 [124]. Этот механизм объясняет неспособность метанола заменить воду, поскольку промежуточное соединение ! Н имеет два отрицательно заряженных атома кислорода.
Гидроксильная группа Туг-248, вероятно, выступает в роли «мостика» при переносе протона от гидроксильной группы тетраэдрического промежуточного соединения Н на атом азота. Возможно, результаты описанных экспериментов и не противоречат друг другу. Имея в виду упоминавшиеся ранее данные о том, что химическая модификация фермента или вытеснение иона металла по-разному сказываются на активности эстеразы и пептидазы, можно предположить, что гидролиз эфира коричной кислоты протекает через образование ацилфермента, тогда ГЛАВА 1З 382 ОН (О1п-270) — С (12,28) ',!/. Хп О ! ~ — Ц вЂ” С вЂ” ХН:СН(К)СО, ! О НО (Туг-248?)' Хп ' г — +НН,СН(Н')Со-, как гидролиз пептидов — по механизму общего оснбвного катализа, в котором роль катализатора выполняет остаток П!п-270.
в. Зимоген Прокарбоксипептидаза А активируется при отщеплении с помощью трипсина около 64 аминокислотных остатков с !)-конца полипептидной цепи [!25[. Этот зимоген обладает довольно высокой каталитической активностью. Проявляя способность гидролизовать небольшие эфиры и пептиды [126, 127], прокарбоксипептидаза отщепляет от лизоцима С-концевой лейцин только в семь раз медленнее, чем карбоксипептидаза. Зимоген гидролизует также бензоил-Йу-1-Р)ге с ))саг 3 с ' и Км = = 2,7 мМ (соответствующие величины для фермента равны 120 с-' и 1,9 мМ) [126[. В отличие от химотрипсина в прокарбоксипептидазе, несомненно, имеется центр связывания и каталитический аппарат практически полностью сформирован.
Кислые протеазы названы так потому, что функционируют при низком рН. Наиболее известный представитель этой группы — пепсин, первый из ферментов, получивший наименование (Шванн, 1825 г,]. К этой же группе относятся химозин (репнин), ! Г, и ! и — с — ннсн(ц')со,— (О Н г (О! п-270) — С 4. Кислые протензы [128 — 130[ ".1,~ У,п*' О! К вЂ” С вЂ” ХНСН(Н')СО; ! Н ОН О (Туг-248?) СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ заз катепсин О, )гп1гориз-пепсин (выделенный из )гп1гориз спгпгпзи) и пенициллопепсин (выделенный из РепгсШгит (ап11нпе))ит). Гомологичны между собой пепсин, химозин и пенициллопепсин [131, !32].
Определена структура нескольких ферментов, но лишь при низком разрешении [133, 134]. Правда, недавно структура пепсина уточнена с разрешением 2,7 А [135], а структура пенициллопепсина [136] — с разрешением 2,8 А. О механизме действия пепсина и пенициллопепсина известно гораздо меньше, чем о механизме действия любой другой кислой протеазы; нет даже никакой простой химической модели, которая могла бы служить руководством при исследовании.
Рассмотренные ниже данные относятся к обоим ферментам, близким по структуре и по своим кинетическим свойствам, а. Пепсин Пепсин, мол. вес которого равен 34 644, состоит из единственной полипептидной цепи, содержащей 327 аминокислотных остатков [137, 138]. Яег-68 фосфорилирован, однако удаление фосфата не приводит к существенным изменениям каталитических свойств фермента [139].
Как и у других кислых протеаз, активный центр пепсина занимает обширнуюобласть,в которую может поместиться по крайней мере четыре-пять, а возможно, и до семи остатков молекулы субстрата [140, 141]. Наиболее благоприятной для функционирования пепсина является такая ситуация, когда по обе стороны от расщепляемой связи находятся гидрофобные аминокислоты.
Статистический анализ процесса расщепления связей в белках показывает, что подцентр 51 специфичен к лейцину, фенилаланину, триптофану и глутамату (!), а подцентр 5( — к триптофану, тирозину, изолейцину и фенилаланину [141]. Пепсин, как правило,не гидролизует эфиры; исключение составляют эфиры (.-р-фенилмолочной кислоты и некоторые эфиры сернистой кислоты. 1. Механизм действия пепсина. Пепсин имеет два катали- тически активных остатка — Азр-32 и Азр-215.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
