Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 63
Текст из файла (страница 63)
Значение рА', основания В всоставетройного комплекса Е.МАР+.КСНЗОН уменьшается, а в составе комплекса Е.МАРН.ВСНΠ— увеличивается. Это означает, что высвобождающийся при окислении протон не покидает тройного комплекса, а захватывается каталитической группой, и наоборот. Высвобождение протона в раствор происходит только при замене одних молекул субстрата другими [18, 41, 63, 71). Столь же четкое объяснение получила и природа специфичности дегидрогеназ.
Энантиомеры субстратов 1-лактат- и Р-глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеназ не могут связываться продуктивно, гидрофобный карман алкогольдегидрогеназы не связывает заряженную боковую цепь лактата и т. д. Происходят ли в процессе катализа конформационные изменения или имеет место деформация — неизвестно. Основная кинетическая особенность МАР+-зависимых дегидрогеназ состоит в том, что МАРН обычно связывается более прочно, чем МАР+. Каковы структурные предпосылки такого различия — неясно; отметим только, что заряженное никотинамидное кольцо более гидрофильно, чем его восстановленная форма в МАРН. Прочное связывание МАРН приводит к тому, что диссоциация комплексов Е.МАРН является в значительной мере лимитирующей стадией при насыщающих концентрациях реагентов и физиологическом рН.
Более того, хотя константа равновесия для реакции окисления в растворе такова, что равновесие сдвинуто в сторону образования МАР+ и спирта, благодаря более прочному связыванию МАРН константа равновесия для связанных с ферментом реагентов оказывается не столь неблагоприятной для образования МАРН и альдегида: константа равновесия между двумя тройными комплексами в реакциях с участием лактатдегидрогеназы близка к единице.
Б. Протеазы Протеазы удобно классифицировать в соответствии с харак. тером их активности и природой функциональных групп. Сериновые протеазы являются зндопептидазами, имеющими реакционноспособный серн~оный остаток, и обладают максимальной активностью при рН, близких к 7,0. Кислые протеазы представ- ГЛАВА П 362 ляют собой эндопептидазы с реакционноспособными карбоксильными группами и обладают максимальной активностью при низких рН (за исключением химозина, активность которого сохраняется вплоть до нейтральных рН). Тиоловые протеазы являются эндопептидазами, отличающимися от сериновых протеаз присутствием реакционноспособных цистеиновых остатков.
Карбоксипептидазы представляют собой цинксодержащие экзопептидазы, специфичные по отношению к определенным С-концевым остаткам белков и функционирующие при нейтральном рН. За исключением лейцинаминопептидазы, мол. вес которой равен 250000, все перечисленные протеазы представляют собой небольшие мономерные ферменты с мол. весом от 15000 до 35000, легко поддающиеся кинетическим и структурным исследованиям, в связи с чем относятся к наиболее хорошо изученным ферментам. Несмотря на то что эти ферменты катализируют одну и ту же реакцию, механизм каталитического действия протеаз разных классов различается.
Некоторые механизмы изучены достаточно полно, для них построены химические модели, другие исследованы лишь в обших чертах. В данном разделе для описания подцентров связывания широко используются условные обозначения, введенные Бергером и Шехтером (уравнение (1.б) ]. (Расщепляемая связь пептидного субстрата занимает участок между подцентрами 81 и 5(, С-конец субстрата занимает подцентры 51 — 8'„, а Х-конец— Б, — 8,.) 1. Серииовые протецзы Эти ферменты уже рассматривались нами в разных разделах. Основной материал распределился следуюшим образом: классификация ферментов, их специфичность — гл.
1, равд. В; структура активного центра, фермент-субстратный комплекс, ацилфермент и комплекс между ферментом и продуктом — гл. 1, разд. Г; кннетика-реакций и установление их механизма — гл.7, разд. Б; рН-зависимость каталитического процесса и состояние ионизации активного центра — гл. 5, разд. Е и Ж.2.а; использование энергии связывания для увеличения й,м — гл, 1О, равд. А.4; стабилизация переходного состояния, специфическая сольватация переходного состояния — гл.
1О, равд. В.5.в. В этом разделе вкратце рассмотрены все перечисленные вопросы. Катализируемый сериновыми протеазамп гидролиз субстратов, эфиров илп амидов, сопровождается образованием промежуточного ацилфермента в результате ацилирования субстратом гидроксильной группы Бег-195. В случае амидов образование ацилфермента при насыщаюших концентрациях субстрата явля- СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЯСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ звз ется медленной стадией, а гидролиз эфиров часто сопровождается его накоплением. Атака Бег-195 карбоксильной группы субстрата, по всей вероятности, приводит к Образованию высокоэнергетического тетраэдрического промежуточного соединения: о о- о 11 н2ΠŠ— ОНŠ— С вЂ” Х вЂ” » Š— Π— С вЂ” Х вЂ” » Š— Π— С вЂ” Н нх о — е — о — с1 — н — е — он+ н — со,н.
он (12. 19) Механизм катализа и структура промежуточных соединений, образующихся в ходе реакций с участием сериновых протеаз, определены с помощью более прямых экспериментов, чем в случае любого другого фермента или класса ферментов. Выяснить структуру сериновых протеаз удалось главным образом благодаря установлению кристаллической структуры сокристаллизованных комплексов трипсииа и некоторых природных поли- пептидов-ингибиторов, имитирующих субстраты (гл, 1, разд. Г).
Из этих исследований известно, что активный центр фермента комплементарен переходному состоянию субстрата, которое структурно очень близко к тетраэдрическому аддукту остатка Зег-195 и углеродного атома карбанильной группы субстрата. Более того, структура фермента при связывании субстрата не искажается. Исследование связывания небольших пептидов с помощью ЯМР-спектроскопии показывает, что при связывании эти пептиды также не деформируются. (Определение кристаллической структуры комплекса трипсина с панкреатическим ингибитором трипсина при высоком разрешении ясно показывает, что реакционноспособная пептидная связь деформируется таким образом, что ее конфигурация приближается к конфигурации пептидной связи в тетраэдрическом промежуточном соединении.
Однако, поскольку эта связь уже деформирована до присоединения к ферменту, <сконструированный» ингибитор связывается очень прочно, т. е. является аналогом естественного переходного состояния.) а. Система с переносом заряда Долгое время полагали, что основный имидазол остатка (ВЕ-57 увеличивает нуклеофильность гидроксильной группы 3ег-!95, действуя как общий основный катализатор: активность ГЛАВА !2 364 понижается при низких рН в соответствии с изменением состояния ионизации основания с рК, - 7, характерным для остатка гистидина; Н!з-57 модифицируется аффииной меткой — тозил-(.-фенилаланинхлорметилкетоном — с необратимой потерей ферментативной активности (гл. 7, равд. Ж) [72].
Н(ч !ч: ) !ч: Н вЂ”,О (12.20) Для кристаллографов явилось полной неожиданностью выявле- ние того факта, что карбоксильная группа Азр-102 также входит в состав активного центра с образованием каталитической триа- ды, названной «системой с переносом заряда» [73].
О, — С 'Н(Я-Ъ Х..НО (12.21) о ' О С ~НГМ 'М:1Н вЂ” О С л — К~Х (12.22! Очень интересно было бы заменить каким-нибудь образом Азр-102 аспарагином и затем определить каталитическую активность такого фермента. По мнению автора,при этом значение Хотя карбоксильная группа полностью погружена вглубь белковой глобулы, она окружена полярными остатками и связанными с белком молекулами воды. Было высказано предположение, что погруженная карбоксильная группа ионизирована в активном протонированном состоянии фермента; позже зто предположение подтвердилось (гл.
5, равд. Ж.2.е) [74]. Еще один сюрприз преподнесли исследователям данные, полученные с помощью ЯМР [75], а затем и с помощью ИК-спектроскопии [76], которые показали, что группа, ионизующаяся с рК, — 7, принадлежит погруженному внутрь белковой глобулы аспартату, а не Н!з-57 (гл, 5, равд.Ж.2). Еслиэти данные правильны, то имидазол Н!з-57 остается непратонированным в химотрипсине вплоть до рН 2, поскольку на графике зависимости активности от рН не обнаруживается данной стадии ионизации при низких рН [77].
Как все зги факторы влияют на катализ — неизвестно. Было высказано предположение, что между Азр-102 и Н(з-57 в ходе реакции (12.22) происходит перенос протона [75]. СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 555 рК, Н!а-67 было бы равно 6, а константа яся! уменьшилась в !О раз (исходя из данных об уменьшении РК, каталитического о н -о нн н" но А Р. с 'нн(+~ын" о он н Н А+ НА Рис. !2.4. Ионизированные состояния системы с переносом заряда. А- — ката. литически активное состояние.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
