Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 58
Текст из файла (страница 58)
Связывание А дает больший вклад в скорость каталитической стадии, чем присоединение В к некаталитическому центру, однако в смешанном комплексе ЕАВ связывание А повышает активность в такой же степени, как и в двойном комплексе ЕА. 4. Стереохимическан природа специфичности Специфичность в отношении конкурирующих субстратов зависит от относительной прочности связывания ферментом их переходных состояний. Комплементарность фермента переходному состоянию субстрата позволяет достичь максимально высокой специфичности, поскольку этим обеспечивается оптималь- СПБПИФИЧНОСТЬ И ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ Ззз ное связывание переходного состояния.
Кроме того, комплементарность является признаком оптимальности значения л„~/Км, что вполне естественно, поскольку специфичность фермента определяется этим параметром. Максимизация скорости сопровождается максимизацией специфичности. Причина, по которой гексокиназа предпочитает фосфорилировать глюкозу, а не воду, заключается в том, что глюкоза в отличие от воды хорошо связывается в переходном состоянии. Каким бы ни был механизм этой реакции !деформация или индуцированное соответствие), исход конкуренции между глюкозой и водой будет одинаковым.
Если допустить, что к'Ф,„для фосфорилирования глюкозы и воды одинакова, а энергия связывания глюкозы используется на уменьшение Кн, то глюкоза будет фосфорилироваться эффективнее благодаря тому, что активный центр предпочтительнее связывает именно глюкозу. Если бы вся энергия связывания глюкозы использовалась для понижения энергии активации стадии, определяющей Р' „, это также привело бы к более эффективному ее фосфорилированию вследствие повышения реакционной способности этого соединения при связывании. Существуют, однако, случаи, когда механизмы деформации или индуцированного соответствия оказывают ощутимое влияние на специфичность. Эти механизмы не имеют значения, когда между субстратами существует конкуренция.
Если же никаких специфических субстратов нет, указанные механизмы могут уменьшить абсолютную активность фермента в отношении, скажем, воды. Так, например, механизм индуцированного соответствия способен предотвратить превращение гексокиназы в «агрессивную» АТРазу в отсутствие глюкозы (хотя такое Отсут.
ствие крайне маловероятно). Б. Сверхснецифичность и механизмы корректировании 1. Синтез белков Ограничения, налагаемые на специфичность различиями в энергии связывания, не обеспечивают должной точности работы некоторых биологических систем. Например, клетка не смогла оы существовать, если бы точность процессов репликации и синтеза белка определялась только описанными выше факторами. Наличие добавочной метиленовой группы у изолейцина может привести к превышению скорости реакции этого соединения с изолейцил-тРНК вЂ” синтетазой над скоростью соответствующей реакции с участием валина в !00 — 200 раз. С учетом того, что концентрация валина !Ппгхо ГЛАВА И ззб в пять раз выше, чем концентрация изолейцина, зто могло бы дать ошибку в скорости, равную 1/20 — 1/40. Однако установлено, что суммарная ошибка в скорости для валина, ошибочно занявшего ЯЦНЛНРОВЯННЕ ГНДРОЛНЗ Оедрародная ГидроФоднал йолосгль амоса ь М сглололоеренае ердлльо раеоюагей водорорьдю селеь Ц, ГИДРОЛИЗ Гид~рофодная ЯЦНЛНРОВЯННЕ Педро!дойная полосни есюолоеолрвние ердллм, дрсиуюасей водородную ' связь Й, Рис.
11.2. Возможиый менаиизм специфичиости, иаправлеииый иа предотврашеиие иеправильиого ацилироваиия тРНК™ треоиииом. А. Гидрофобиый центр ацилироваиия, избирательно связываюший треоиии. Б. Гидролитический центр использует энергию связывания гидроксильиой группы треоиииа для саязываиия или катализа. Как показаио иа рисуике. ацильиая группировка перемешается из положения 2' в положеиие 3' [3]. в белке место изолейцина, составляет только !/3000 [1). Эта сверхспецифичность обусловлена наличием корректирующего механизма 1ес)!1!пя тес1зап1зш).
Изолейцил-тРНК вЂ” синтетаза не только выполняет свои обычные биоспнтетические функции, но и обладает гидролитической способностью. Параметр йсеь/Кь! для образования связанного с этим ферментом валил- СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ 337 аденилата будет примерчо в 150 раз меньше, чем при образовании изолейциладенилата.
Однако в то время как присоединение тРНКИ» к правильному комплексу ведет к образованию 1!Е-ТРНКП«, Прн ПрИСОЕдИНЕНИИ ЧЕПраВИЛЬИОГО КОМПЛЕКСа Валиладенилата Образуются валин и АМР, а не Ча!-ТРНКН« [2). В присутствии валина, АТР и тРНКСМ изолейцил-тРНК вЂ” синтетаза функционирует как АТР-пирофосфатаза — непроизводительно, но по необходимости гидролизуя АТР до АМР. Пе, АТР тРНКП» Š— » Е.11е АМР— — » Пе-ТРНКП«+ АМР+ Е, (11.14) Нек Атр «РНК~~« Е Ф Е.'»а1 АМР— — н»а1+ тРНКпе+ АМР+ Е. (11.15) Для реакции отщепления треонина валил-тРНК вЂ” синтетазой удалось установить механизм специфичности (гл.7.
равд. Г) (3). Этот фермент имеет отдельный гидролитический центр для Е»м тра Аввдеенно Е, АА. АГР тРНК вЂ” ~- ЕЛА АМР тРНК вЂ” ~ КАЛ-гРНК+АМР Ррс Геавная стадия 1 »одре ем роеания1 ееааая чиа» Е»АА«АМР» гРНК Рис. 11.3. Один из вариаитов мехаиизма «двойиого сита», в котором стадия корректирования предшествует стадии переноса амииокисаотм иа тРНК. гидролиза Т)1г-ТРНК»" и образует треониладенилатный комплекс с й«еп)(м примерно в 600 раз меньшей, чем при образовании валиладенилата. Т)1г-ТРНК»»1 очень быстро гидролизуется с числом оборотов 40 с-'. Ча1-ТРНК»" гидролизуется медленно, число оборотов составляет лишь 0,015 с-'. Ясно, что гидролитический центр фермента для обеспечения специфического связывания треонина должен быть способен образовать водородную связь с гидроксильной группой последнего. Гидрофобный валин связывается с гидролитическим центром значительно слабее, гидролизуясь приблизительно в 3000 раз медленнее.
В процессе эволюции природа создала специфический механизм использования структурного различия, реализующийся в двух случаях: один раз — для узнавания нужного субстрата на стадии биосинтеза, а другой — для узнавания неправильного субстрата на стадии расщепления (рис. 11.2). Наиболее сложен процесс распознавания изолейцила и валина таким ферментом, как изолейцил-тРНК вЂ” синтетаза. Дело в том, что в Е.со!1 содержание валина в пять раз превышает ГЛАВА П содержание изолейцина [4). В этом случае может иметь место механизм двойного контроля, при котором большая часть валиладеиилата деградирует еше до переноса к тРНК'".
Далее изолейцил-тРНК вЂ” синтетаза использует свою гидролитическую МЕНЫУИЕ ПО РАЭМЕРИ Аминокислоты птоходят онвть.пито" Актнплцин гилтолитичеокнй цент~ ЯОАЬШНЕ ПО РАЭМЕРУ Аминокислоты не ОРМОАОТ шгооэь,Энто" ЦЕНТР РИО -И туг — и Оги Уаг пв О1— УО1 — « ПΠ— К ив-тРНК Рис. 11лй Мехаиизм «двойиого сита», моделирующий процесс корректироваиия работы изолейцил-ТРНК вЂ” сиитетазы. Активный цеитр, где происходит образоваиие амииоациладеиилатв, «отторгаеть амииокислоты, большие, чем изолейции, и связывает меиьшие по размеру амииокислоты.
Аиалогичиым образом гидролитический центр, размеры которого достаточны для связываиия валина, отторгает изолейции и присоединяет валки и все меньшие по размеру амииокислоты. активность, ликвидируя все молекулы тга!-ТРНКп«, которым удалось пройти через первый «пропускной пункт» [5). Этот механизм аналогичен «двойному ситу» (рис. 11.4). 2. Механизм корректирования при репликации ДНК [61 Процесс репликации ДНК характеризуется чрезвычайно высокой точностью. Частота мутации для Е.сой составляет 10-'— 10-з, и, следовательно, точность репликации ДНК либо равна указанным величинам, либо еще больше [7). Это подтверждается результатами исследования 1п ч11го ДНК-полимеразы из Е, сон и фага Т4, согласно которым вероятность ошибки составляет менее 10 — ' [7, 8). Такая точность обеспечивается сложной системой корректирующих механизмов.
Основное различие между процессами синтеза белка и ДНК состоит в том, что в последнем случае исправить ошибку относительно легко. При синтезе белка растущий конец полипептидной цепи активируется и переносится к следуюшей в цепи аминокислоте. В этом случае удалить неправильный аминокислотный остаток и «реактивировать> полипептид невозможно. Ошибку необходимо исправить до полимеризации. При синтезе специоич1тость и ОтнОсительнАя реАкциОИИАя спОсОББОсть 339 же ДНК активируется мономерный нуклеотид, присоединяющийся к неактивированной растущей цепи.
Это позволяет исправить ошибку уже после завершения полимеризации. Молекула ДНК синтезируется в направлении 5' — 3' (нуклеотиды присоединяются к 3'-гидроксильной группе полинуклеотида), а все ДНК-полимеразы прокариот расщепляют цепь в направлении 3' — 5' 1рис. 11.6). Имеются веские данные в пользу наличия механизма вырезания ошибочно присоединенных 3' Ю' ымр-рр т Ъ 1 ,о ""-с" мнз-дд-с" ! о о танк грнк Корпвкткпзвание с нтаеткш зкзаниккедзы Рис.
11.6. В ходе сиитеза молекулы ДВК происходит присоединение активироваииого дезоксииуклеотидмоиофосфата к Зсгидроксильиой группе растущей цепи. Корректироваиие происходит в обратном направлении. Рис. ! 1.б. В процессе синтеза молекулы белка происходит перемешеиие активироваииой полипептидиой цепи к следукпцему амииокислотиому остатку. Оснований с участием этого фермента. Во-первых, показано, что экзонуклеаза наиболее эффективно гидролизует участки, содержашие ошибочные основания, а также одноцепочечнуго ДНК [9, 10). Во-вторых, частота мутаций у фага Т4 коррелирует с экзонуклеазной активностью, проявляемой ДНК-полимеразой. Штаммы, обладаюшие очень высокой скоростью мутации, синтезируют ДНК-полимеразу с низкой экзонуклеазной активностью (табл.
11.1) [7). Штаммы, устойчивые к мутациям, обладают высокой экзонуклеазной активностью. Из табл. 11.1 видно, что эти штаммы гидролизуют расточительно большие количества дезоксинуклеозидтрифосфатов, чтобы включить единственное основание [11). В-третьих, обратная транскриптаза из РНК-содержашего вируса миелобластомы птиц, которая синтезирует ДНК с использованием РНК в качестве матрицы, не обладает 3' — 5'-экзонуклеазной активностью и частота неправильного включения цитидина составляет 1/600 глава и 340 [8]. Следует отметить, что корректирование должно осуществляться полимеразой, а не репарируюшим ферментом, включающимся на следующей стадии, поскольку при синтезе двухцепочечной ДНК нельзя было бы выяснить, какое именно из двух спаренных оснований было включено по ошибке.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
