Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 54

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 54)

10.7). Эта идея была предложена для объяснения низкой скорости деацилирования ацилхимотрипсинов 119]. 4. Независимость специфичности фермента от напряжения, индуцированного соответствия и непродуктивного связывания Специфичность фермента, заключающаяся в его способности распознавать один из конкурирующих субстратов, не зависит от того, какой из трех перечисленных выше механизмов имеет место. Подробно этот вопрос обсуждается в гл.

11, но по существу все дело здесь в том, что специфичность зависит от й„~/Км, а напряжение и непродуктивное связывание не влияют на эту величину (уравнения (10.10) и (3.36)). Из уравнения (10.16) видно, что индуцированное соответствие просто изменяет параметр й, ~/Км для активной конформации фермента в равной мере по отношению ко всем субстратам (т. е. в К раз). 5. Экспериментальное подтверждение существования напряжения и индуцированного соответствия и природа этих явлений а. Стационарная кинетика Хотя данные стационарной кинетики обычно интерпретируют в рамках одного из указанных выше механизмов, какой именно из них реализуется — решить трудно, и выбор всецело зависит от воли экспериментатора. Как правило, при этом сравнивают З1В ГЛАВА»В величины йс.»)Км для нескольких серий субстратов (как в табл.

10.1 и 10.2), чтобы убедиться„ что специфичность проявляется в увеличении й„ь а не в уменьшении Км. В таком случае экспериментатор получает четкие указания на выполнимость какого-то одного из механизмов, но, как уже отмечалось, не может определить, какого именно. Дело в том, что все три механизма приводят к одному и тому же результату: энергия связывания превращается в энергию активации для химической стадии. Рассмотрим этот момент несколько более подробно. Деформация: дополнительные группы в ббльших по размеру субстратах участвуют в деформации субстрата, а не в связывании.

(В рамках теории стабилизации переходного состояния это Раса»ааавааа лл — лл — лл — лл — лл — лл Рнс. 10.8. Подцентры связывания властазы. положение формулируется так: «Дополнительная энергия связывания не реализуется до тех пор, пока не образуется переходное состояние».) Индуцированное соответствие: дополнительные группы в ббльших по размеру специфичных субстратах участвуют в деформации фермента. Меньшие по размеру неспецифичные субстраты присоединяются преимущественно к неактивной форме фермента. Это приводит к уменьшению й„» ввиду уменьшения продуктивного связывания, однако соответственно уменьшается и Км, поскольку энергия связывания не используется для превращения неактивной конформации в активную.

Непродуктивное связывание: ббльшие по размеру субстраты связываются только продуктивно, а меньшие, обладая способностью к слабому продуктивному связыванию, связываются еще и непродуктивно, уменьшая Км. Соответственно уменьшается и »'са». Несмотря на то что иа основании данных стационарной ки. нетики, сравнивая й„» и Км, различить механизмы деформации и индуцированного соответствия невозможно, иногда удается получить дополнительную информацию, позволяющую сделать выбор между этими двумя механизмами. Одним из характерных примеров такого рода является исследование эластазы [20), Параметр й„» для гидролиза АсРгоА1аРгоА!а-ХНз в сотни раз больше, чем для гидролиза АсА!аРгоА!а-ХН» (табл. 10.1). Объяснить это различие непродуктивным связыванием не удается, з!т ТЕОРИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА поскольку наличие последовательности А!аРгоА!а должно было бы обеспечить продуктивное связывание.

Сравнение связывания субстратов и аналогов переходного состояния указывает на то, что остатки в подцентрах 34 — 84 дестабилизируют группу -СОгчН», энергия гидролиза которой составляет 8 кДж моль-' (2 ккал.моль-'),относительно переходного состояния. Аналоги переходного состояния, в которых группа — СОНН» замещена на — СНО, образуют тетраэдрический аддукт с Бег-!95, моделируя подобное тетраэдрическому промежуточному соединению переходное состояние гидролитической реакции.

Связывание этих аналогов усиливается при занятии подцентров Б, и ЬФ Ответить а рНоп' на вопрос, чем обусловлена взаимная дестабилизация между подцентрами 54 — 8» и амидной группой субстрата — передающимся через белок конформацнонным изменением или неблагоприятным взаимодействием, уменьшающимся при образовании переходного состояния,— невозможно.

б. Предстационарная кинетика и эксперименты по связыванию Известно довольно много примеров, когда добавление к ферментам субстратов и ингибиторов сопровождается изменением флуоресценции и кругового дихроизма, что свидетельствует об индуцируемых в ферментах конформационных изменениях (21]. Во многих случаях эти процессы исследованы методами изучения быстрых реакций. Однако полученные данные, как правило, нельзя объяснить в рамках какого-либо конкретного механизма. в.

Рентгеноструктурный анализ Наиболее обширная информация получена при исследовании кристаллических ферментов методом рентгеноструктурного анализа. 1, Лизоцим4 механизм напряжения2 При гидролизе лизоцимом полисахаридов кольцо сахара, связанного с подцентром О, превращается в карбоний-ион, меняя свою конформацию с «кресла» на <софу» (гл.

! и гл. 1О, равд. А.4.б). Построение моделей для этой системы подтвердило, что субстрат, связывающийся с подцентром О, вынужден принять конформацию «софы» вследствие неблагоприятных взаимодействия с ферментом, т. е. в данном случае действует классический механизм деформации [22). Позднее Левитт еще раз проанализировал связывание лизоцима с (НАО) 4, использовав более точные координаты атомов этого фермента и проведи весьма сложные расчеты его взаимодействия с субстратом вместо построения проволочных ГЛАВА 1О З)В моделей [8„23).

Координаты фермента и субстрата оптимизи. ровались путем выражения длин всех связей„ углов между свяаями, торсионных углов и расстояний между несвязанными ато- -4г- 8 -!. -го -го бо -)го гб о об ао О,, о,, арабизм Рис. 10.9. Зависимость энергии связывания (ап) сахарного кольца с подцен. тром !) лизоцима для субстратов ()ЧАС)« с искусственно фиксированной структурой от величины торсионного угла ес, ~г 1 — суммарное изменение свободной энергии прн связывании; г — вклад торснонных напряжений; Π— вклад угловых напряжений; 4 — вклад нековалентных взаимодействий (см.

текст). Для конформации «кресла» угол Ос, о, — — — 60', а для полу. кресла — 0' (6). мами в виде эмпирических энергетических функций и минимизации энергии с помощью ЭВМ. Результаты, полученные для Р-подцентра и присоединяющегося к нему сахарного кольца, представлены на рис. 10.9. Использованы три типа приближения. Первое ( ° ) предполагает, что субстрат обладает гибкостью и подгоняется к жесткому ферменту.

Согласно второму (зй,), гибкостью обладают и фермент, и субстрат и оба они участвуют в достижении наилучшего соответствия. Третье приближение ТЕОРИИ ФЕРМЕНТАТИЕНОГО КАТАЛИЗА з(в (Щ$) основано на допущении, что фермент обладает лишь незначительной гибкостью. Как видно из рисунка, наиболее благоприятной во всех случаях является ситуация,отраженная в левой части рисунка, когда субстрат имеетконформацию кресла.

Это подтверждает представление о том, что субстрат, связываясь с подцентром Гл, имеет форму кресла и не изменяет свою конформацию на «софу» вплоть до образования карбоний-иона (или переходного состояния). Классический механизм деформации субстрата, по-видимому, вряд ли имеет место, хотя исследования с помощью аналогов переходного состояния указывают на возможность стабилизации переходного состояния.

2. Гексокинозаг индуцированное соответствие. Имеются веские данные в пользу того, что в гексокиназе дрожжей, которая фосфорилирует глюкозу с участием концевого фосфата молекулы АТР, достигается индуцированное соответствие между ферментом и субстратом. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, связывание как сахара, так и нуклеотида вызывает существенные изменения в третичной структуре фермента. Кроме того, присоединение нуклеотида к одной из форм фермента облегчается связыванием сахара (24, 26).

Эти результаты согласуются с результатами более ранних исследований АТРазной активности этого фермента в растворе в отсутствие глюкозы. Гексокиназа фосфорилирует глюкозу в положении 6 с )т,„= 800 мкмоль мин-' на 1 мг белка и Км для АТРО,! мМ. В отсутствие глюкозы АТР гидролизуется с 1),„= = 0,02 мкмоль мин — ' на 1 мг белка и Км = 4,0мМ. Добавление ликсозы, которая не может фосфорилироваться вследствие утраты оксиметильной группы в положении 6, приводит к увеличению )т „для реакции с участием АТРазы в 18 раз; при этом величина Ам для АТР уменьшается в 40 раз, т. е. до значения Км, характерного дая фосфорилирования глюкозы 126, 27).

Ксилоза вызывает изменения в кристаллической структуре фермента, аналогичные изменениям, индуцируемым глюкозой (рис. 10.10). НОСН Н О Он ОН О Н ОН О Е-,У-елюкола ,в-В-ксилооа ,в-л- лигсола 3. Сериновые протеазы: стабилизация переходного состояния. Химотрипсин и сериновые протеазы относятся к числу на- ГЛАВА 10 320 иболее изученных ферментов благодаря использованию рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением для исследования этих ферментов и их комплексов с природными полипептидными ингибиторами, моделирующими субстраты (гл.

Характеристики

Список файлов книги