Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 57
Текст из файла (страница 57)
Ограничения, налагаемые на специфичность Центральную проблему специфичности можно сформулировать так: каким образом фермент отличает специфический субстрат от другого, меньшего или равного ему по размеру (изостерического) субстрата? Отличить больший по размеру субстрат от специфического субстрата нетрудно, поскольку полость фермента, в которой происходит связывание, может быть достаточно велика, чтобы связать небольшой специфический субстрат, но слишком мала, чтобы в нее поместилась более крупная молекула конкурирующего субстрата. Однако небольшой по размерам субстрат не встречает таких стерических препятствий.
В этом случае энергия связывания, используемая в катализе, будет меньше. Такие примеры были рассмотрены в разделе, посвященном сериновым протеазам. Большие по размеру производные ароматических аминокислот не могут связываться небольшим связывающим карманом эластазы в отличие от меньших по размерам производных аминокислот, способных связываться и реагировать с химотрипсином. Однако, как обсуждалось в начале предыдущей главы, реакции с участием меньших по размеру субстратов характеризуются значительно меныпими значениями параметров йАА! и йса!/Кн. Различить субстраты не составляет труда и в том случае, если между ними имеются существенные стереохимические различия.
Как указывалось в конце гл. 2, при замене ) -аминокислоты Р-аминокислотой происходит такая перестановка двух групп у хирального атома углерода, что продуктивное связывание субстрата становится невозможным. Гораздо труднее различить субстраты в реакциях, протекающих с участием аминоацил-тРНК вЂ” синтетаз — ферментов, которые должны с высокой точностью выбрать нужную аминокислоту. Два примера такого рода — конкуренция между валином и изолейцином за активный центр изолейцил-тРНК вЂ” синтетазы и между треонином и валином за активный центр валил-тРНК вЂ” синтетазы (рис.
11,1). Валин, отличающийся от изолейцина отсутствием одной метиленовой группы, связывается с изолейцил-тРНК вЂ” синтетазой в сотни раз слабее. Треонин, несмотря на то что он изостеричен валину, связывается с валил-тРНК вЂ” синтетазой в 100 †2 раз слабее, поскольку в гидрофобный карман, обычно занимаемый метиленовой группой валина, погружается теперь гидроксильная группа. Эту ситуацию можно проанализировать, воспользовавшись теорией переходного состояния, как это сделано прн рассмотрении комплементарности между ферментом и субстратом в предыдущей главе.
Энергия активации данной реакции представ- глава и ззо ляет собой сумму двух составляющих; одна из них — энергия активации для стадии химического превращения субстрата, а другая — энергия связывания фермента с субстратом, Если меньший по размеру или изостерический субстрат отличается от специфического субстрата отсутствием элемента ц, который Иллиииил -тРУег- сиюлеага ли Валил-лгРуу11— сингпапаза Рис.
11.1. Полость в активном центре изолейцил-тРНК вЂ” синтетавы способна связывать валин, поскольку она связывает больший по размеру изолейцин. Активный центр валил-тРНК вЂ” синтетавы не может «отторгнуть» треоиин, так квк он ивостеричен валину. имеет потенциальную энергию связывания Лбов, максимально возможное различие в скорости реакции, обусловленное этим стереохимическим фактором, равно ехр1 — 1з1зсгь!ЙТ) и не может увеличиваться за счет деформации, индуцированного соответствия, ряда конформационных изменений, наличия дополнительных стадий химических превращений или двух (или большего числа) одновременно функционирующих центров. Впервые это было показано для частного случая — механизм Михаэлиса — Ментен,— а затем обобщено навседругиемеханизмы. Как мы увидим дальше, специфичность обусловлена связыванием именно переходного состояния.
специФичыость и ОтносительнАя РеАкционнАЕ спосовность 33! 1. Механизм Михаэлиса — Ментен В гл. 3, равд, Ж.2 было показано, что специфичность в случае конкурирующих субстратов определяется величиной йсм/Км. Если скорость реакции с участием специфического субстрата А обозначить через ОА, а соответствующую скорость для конкурирующего субстрата  — через ое, то можно записать РА/ьв (А! (Аса1Км)А/(Н) (АсаЗКм)в (11.1) Воспользовавшись уравнениями (10.3), (10.4) и (10.10), это соотношение можно представить в виде !е (А„,/Км) = М (Ат/Л) — (Ласс + Ааь), (11.2) где Лбс — энергия активации для стадии химического пре- Ф вращения субстрата, а Лбь — энергия связывания переходного состояния субстрата ферментом.
Если дополнительная группа й субстрата А не претерпевает химического превращения в ходе данной реакции, то Лб~~ для А и В будет одинакова, если не принимать во внимание индукционные эффекты. В таком случае, положив разность энергий связывания равной ЛЛбь, из уравнения (11.2) получаем (Асм/Км) /(Ьсм/Км) схР ( — Лаоь/ЙГ) (11 3) где ЛЛбь — отрицательная величина. Уравнение (11.3) дает максимальный эффект, к которому может привести связывание дополнительной группы. Если при переходе от А к В лимитирующей становится другая стадия, то энергия активации уменьшается на величину, меньшую ЛЛбь.
Кроме того, если в случае субстрата В наряду стем способом связывания и химического превращения, которые реализуются в случае субстрата А, существуют иные, это будет приводить к увеличению суммарной скорости реакции. Как мы увидим, высказанное ранее предположение о том, что специфичность обусловливают перечисленные ниже механизмы, не подтверждается. а.
Деформация Как было показано в гл. !О, деформация не влияет на величину /сем/Км, так как вызывает одинаковые изменения /с,„~ и К„. б. Индуцированное соответствие В той же гл. 10 указывалось, что в случае индуцированного соответствия отношение й и/Км равно просто отношению й ~/Км для активной конформации, деленному на постоянный для всех субстратов коэффициент [уравнения (10,!4) и (!0.17)].
Индуцированное соответствие не изменяет значения йсм/Км по ГЛАВА П сравнению с соответствующей величиной для случая, когда весь фермент находится в активной конформации, и, следовательно, не влияет на специфичность. в. Непродуктивное связывание Согласно данным гл. 3, равд.
Д, при непродуктивном связы- ВВНИИ ОТНОШЕНИЕ йса!с1КМ НЕ ИЗМЕННЕтея, а Ьса1 И КМ умсньша" ются в одинаковой степени. Специфичность, таким образом, остается прежней. г. Последовательность реакций Специфичность фермента не повышается, если ферментативная реакция проходит через ряд последовательных стадий, каждая из которых характеризуется энергией баба. Проще всего понять этот факт, обратившись к гл. 3, равд.
Е, откуда станет ясно, что для реакции (!1.4) отношение йса1уКм всегда равно йх/Ка независимо от числа промежуточных стадий. Кз аа , Аз „ Ьа Е+ 8 ч==~ Е8 — ~ Ез' — ь Еза — ь Ез"' и т. д. (11.4) 2. Общий случай Для анализа вклада энергии связывания в свободную энергию активации для каталитической стадии в общем случае можно использовать следующий формальный термодинамический подход. Рассмотрим последовательность реакций Лимитирующая стадия Е+ 8 ч:ь Е8 ч:::Ь Е'8' ч=ь Еаз" ч=ю ~ь ч=ь Еюзт ю (11.5) где Е, Е', Е" и т. д.
различные состояния фермента, а 5, $', 5" — различные состояния субстрата. Скорость реакции можно рассчитать из теории переходного состояния, пренебрегая всеми промежуточными стадиями, а просто рассматривая энергетику процесса Е+ Б- Еэ5э. Свободная энергия активации Гиббса представляет собой сумму трех составляющих: изменения свободной энергии ЛОВ~, представляющего собой разность энергий состояний Е и Е, Ьбз — разности энергий состояний Ьт и 5 и Ьбь — энергии связывания Ет и 5Ф. ЕР + зт,. '~АОь Аа"~ Ааф~ АОГ Е + 8 .и Е*зт Схема ! спсииеичнОсть и ОтносительнАя рехкционнхя спосов!1Ость 333 Из термодинамического цикла, представленного на схеме 1, видно, что энергия активации ЛОТ равна ЬО~ = ЬО~~ + ЬОБ + ЬОе. (1 1.6) Согласно теории переходного состояния, скорость реакции определяется выражением е= [Ат!з! [е[ [31ехР [ — (ЛОБ~ + АОБУ + АОе )Йт~.
(11.7) Относительные скорости реакций с участием субстратов А и В можно получить, подставив значения энергии Гиббса для А и В в уравнение (1!.7) и взяв отношение скоростей: РА/ев —— ([А[/[в[1 ехр [ - (ААОь + АОА — АОБ)/ет]. (11.8) Разность в энергиях связывания субстратов А и В, ЛАЙТЕ входит в уравнение только один раз.
ЛЛ6ь нельзя увеличить, суммируя соответствующие величины для каждой из стадий. Специфичность, обусловленная ЬЛ6ь, просто «распределяется» по этим стадиям. Для подобных субстратов Лбх будет близка к Лб~~, так что РА/ев = ([АЦВ[1 ехр ( — ЬЬОе|[ЦТ) (1 1.9) Этот подход можно использовать и для анализа связывания обычных косубстратов, например [х[А[1+ или АТР. Происходящие при этом изменения энергии Гиббса сокращаются, как и в случае с Лбе~ при определении отношения скоростей из уравнения (1!.7) или аналогичного ему уравнения.
3. Взаимодействующие активные центры Может ли увеличиться специфичность при связывании с ферментом, имеющим несколько центров связывания, более чем одной молекулы субстрата? Такая возможность не исключается для систем [п тнго, когда присутствует только Один субстрат и анализируется абсолютная скорость, а не различие между субстратами.
Однако в реальных биологических системах, где имеются специфические н конкурирующие субстраты, специфичность увеличиваться не может, поскольку в реакции участвуют смешанные комплексы, содержащие фермент и оба субстрата. Это можно показать с помощью формальных термодинамических выкладок. Рассмотрим случай, когда реакционной способностью обладает половина активных центров, и одна молекула субстрата, 8е, связывается с ферментом, но не претерпевает химических превращений с образованием продукта в отличие от ГЛАВА 11 334 второй молекулы, Я. Сравнение скоростей реакций с участием пары комплексов, например Е.А.А' с Е.В.А«, показывает, что дополнительная энергия при связывании большего по размеру субстрата, ЛЛ6ь используется только «один раз».
Ее -)- 3Е + 8'е (Аль) +(ааь)з, Аов ~ Апз~~ Аф~ Ааф Ь« Е + 3 + 3. — Е«3«3"* Схема П Согласно теории переходного состояния, выражение для скорости имеет вид е= (Ат//1) 1е) 18) 1$') ехр ( — (лов~+ доз + доз~ + (лоь) + (аоь)з, )/1(т~ (1!.10) Если субстрат А связывается прочнее, чем субстрат В из-за различия в структуре, обусловливающего разный вклад в энергию связывания ЛЬ6ь, и если ох .
— скорость реакции для случая, когда субстрат А связывается с центром, осуществляющим химические превращения, а  — с другим центром, то, подставляя выражение для энергии Гиббса в уравнение (11.7) и полагая Л6А« = Ь6в, получаем »АА /евх = ((А)/[е!) ехр (- ььоь//!т) (11.1!) и ехв /евв" = ()А)/)В)) ехр ( — аапь|ЯТ) (11.12) так что ("АА + "Ав»)/("ах*+ 'вв*) = )А)/)в! ехР ( — ааоь/йт) (! 1.13) При образовании смешанных комплексов А и В с ферментом специфичность не может увеличиться в результате одновременного связывания двух молекул субстрата.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
