Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 61
Текст из файла (страница 61)
е. 5[АРР) протекают значительно медленнее соответствующих реакций с участием немеченых соединений (йн7йо = 3 — 5) [14, 20]. Это показывает, что перенос гидрид-иона (или дейтеридиона) осуществляется в ходе лимитирующей стадии реакции. Измерение константы скорости переноса гидрид-иона в случае алкогольдегидрогеназы печени лошади с помощью предстационарной кинетики выявило наличие аналогичных изотопных эффектов [21, 22].
Основной момент, остающийся неясным для рассматриваемого механизма, касается координационного числа иона Хп'+ и состояния ионизации его лигандов. Соответствующие данные были получены при исследовании зависимости реакционной способности фермента от его структуры и рН-зависимости скорости реакции. Установлено, что й„~ для реакции окисления спиртов алкогольдегидрогеназой дрожжей и й„~ для реакции восстановления бензальдегидов алкогольдегидрогеназой печени слабо зависят от способности реагирующих атомов принимать или отдавать электроны [14, 15, 20, 23, 24]. Возможно, это обусловлено тем, что перенос гидрид-иона осуществляется по механизму общего кислотно-оснбвного катализа (т. е. образующийся при переносе гидрид-иона заряд нейтрализуется синхронным переносом протона от кислородного атома субстрата или на этот атом).
Однако никакой боковой цепи, которая находилась бы достаточно близко к субстрату, чтобы выполнять каталитическую функцию, не обнаружено. Было высказано предположение, что карбонильная группа субстрата присоединяется не к самому иону цинка, а к связанной с ним молекуле воды [25]. Хотя это согласуется с предположением о наличии общего кислотно-оснбв. ного катализа, в котором связанная с цинком вода играет роль ГЛАВА $2 Еп ' Н вЂ” О О С вЂ” К' ХА.."Н С К ' "г+ Ул" Н вЂ” 0 О Н~~ 1ЧАР— Н (12.4) Для выяснения состояния ионизации каталитической группы была исследована рН-зависимость скорости ферментативной реакции. При окислении и-метилбензилового спирта, катализируемом алькогольдегидрогеназой дрожжей, йсм возрастает при увеличении рН и определяется состоянием ионизации основной формы группы с рК.=8,25, тогда как при восстановлении ацетальдегида параметр й„~/К„возрастает при уменьшении рН и определяется состоянием ионизации кислой формы группы с рК.
=8,25 [27). Это не противоречит механизму (12.4), поскольку связанные с цинком молекулы воды в модельных соединениях ионизируются именно в этой области рН [28). Значительно труднее интерпретировать рН-зависимость й„~ для реакций, катализируемых нативной алкогольдегидрогеназой из печени лошади. Скорость восстановления альдегидов мало изменяется в диапазоне рН от 6 до 1О [15), что можно рассматривать как довод в пользу выполнения механизма (12.3) [29).
Если имеет место механизм (12.4), то рК. связанной с цинком молекулы воды в тройном комплексе с МАРН и альдегидом должен быть относительно высоким, а рК, связанного с цинком гидроксильного иона в тройном комплексе с НАР+ и альдегидом — относительно низким [15). Аналогичным образом, если справедлив механизм (12.3), то связанный с цинком алкоголятион должен иметь необычно низкое значение рК,.
Вопрос о том, обладают ли реакционной способностью все активные центры молекулы алкогольдегидрогеназы или половина их, остается открытым. Хотя этот фермент связывает два моля НАР+ с одинаковым сродством, считается, что в катализе участвует только один активный центр. обшей кислоты, а связанный с цинком гидроксил-ион — обшего основания, геометрия указанного комплекса, по-видимому, противоречит данным рентгеноструктурного анализа [26). Согласно другой гипотезе, связанная с цинком молекула воды выполняет роль катализатора, а субстрат присоединяется координационной связью непосредственно к атому цинка. При этом предполагается, что связывание субстрата с цинком не приводит к вытеснению молекулы воды, а увеличивает координационное число цинка до пяти [уравнение (12.4)) [15).
стгхктхвл и мвхх»»нзм двпствия отдельных еввмвнтов 2. [.-лактатдегндрогеназа [4, 6, 32] !.-лактатдегидрогеназа катализирует обратимое окисление 1-лактата до пирувата с использованием в качестве кофермента НАР»' сн, сн» Н вЂ” С вЂ” ОН+ !ЧАР+ ч=ь С О+ НАРН+ Н+ 1 1 со; со; (12.5) а. Структура фермент-субстратного комплекса Структура тройных комплексов была определена из кристаллографических исследований [37] связывания аддукта НАР— пируват, который можно раесматривать как аналог связанных ковалентной связью пирувата и МАРН [38]: г Н, Нф СО; СО!4» Н, Этот фермент, выделенный из многих источников, представляет собой тетрамер с мол. весом 140000.
Он может существовать в двух формах: Н,, преоблада»ошей в сердечной мышце, и М», преобладающей в скелетной мышце [33, 34]. Эти формы называются изоферментах»и — разными молекулярными формами одного и того же фермента. Аминокислотный состав форм М» и Н» существенно различается; кинетические свойства изоферментов также неодинаковы. Несмотря на это, свойства центров ассоциации субъединиц весьма близки, поскольку вероятность образования таких гибридных форм, как М»Н, М»Нх и МН„ определяется чисто статистическими факторами [35]. В ходе каталитической реакции субъединицы никак не взаимодействуют между собой, так что кинетические свойства, например, формы Н,М и смеси форм Н» и М, в соотношении 3: 1 идентичны. Кристаллическая структура апофермента, выделенного из аку.
лы, была установлена с разрешением 2,0 А, а его комплекса с аддуктом НАР— пируват — с разрешением 2,8 А [36]. Молекула фермента симметрична, а субъединицы структурно эквивалентны. ГЛАВА гв Скорее всего активные тройные комплексы имеют следую- и!ую конформацию: (Н(з-195', 'О ,1 Г-" сн, с н,)ч ° лнн, ) нн г' (Агу-171) (12.7) ' См.
также Сугробова Н. П., Курганов Б. И., Яковлев В. А., Молек. биология 8, 716 — 722 (1974); Вигкпег Л Цг., Агав!1е С. к., зг., С!е1апд Ъг'. '1Ч., йау Цг. Л, зг., В1осьепт!в!гу 17, 1646 — 1653 (1978); Вигкпег 7. %., Иау %. 3., Зг., В1осиепп1всгу 17, 1654 — 1661 (1978); Цг1!1оп П.
С., В!оскепг. 7. 177, 951— 957 (1979), — Прим. ред. Карбоксильная группа субстрата образует ионную связь с боковой цепью Агу-171. Гидроксильная группа лактата связана водородной связью с непротонированным имидазольным кольцом Н)8-195, в то время как карбонильная группа пирувата образует водородную связь с протонироваиным имидазолом. Н)з-195 не только участвует в ориентации субстрата, но и действует как кислотно-основный катализатор, стабилизируя отрицательный заряд, который образуется на кислородном атоме пирувата в ходе реакции, и способствуя отгдеплению протона от лактата при окислении. Лддукт 14ЛР— пнруват образуется из )чАР+ и еноленой формы пирувата в присутствии фермента ~39) ' (в обычной реакции субстратом является кето-таутомер 1401). Предполагается, СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕНСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ ззз что как и при окислении лактата, в роли катализатора в этой реакции выступает Н!з-195: СО)Ч Н.
[НЫ-1 95) (12.8) 1 С О вЂ” О б. Кинетический механизм [6, 41[ Лактатдегидрогеназа связывает лактат или пируват только в присутствии кофермента [42[. Следовательно, имеет место упорядоченный механизм, причем первым связывается кофермент. Об этом же свидетельствуют кристаллографические данные: присоединение кофермента индуцирует конформационное изменение, при котором аминокислотные остатки в цепи от 98 до 114 перемещаются на относительно большое расстояние, приближаясь к активному центру в тройном комплексе [36, 37].
Применение методов исследования быстрых реакций показывает, что этот механизм несколько отличается от механизма действия алкогольдегидрогеназы из печени лошади, но лимитирующей стадией в обоих случаях является диссоциация комплекса Е.й)АРН [41, 43[. В случае алкогольдегидрогеназы скорость высвобождения альдегида из тройного комплекса Е.ЙСНО.5)АР выше скорости переноса гидрид-иона, так что эти два тройных комплекса никогда не находятся в равновесии. Однако в реакциях, катализируемых лактатдегидрогеназой, перенос гидрид-иона происходит очень быстро, а пируват высвобождается медленно, и тройные комплексы находятся в равновесии.
При нейтральных рН равновесие сдвинуто в сторону образования лактата и Р)АР+. При смешивании лактата с голо- ферментом при рН 7 в течение первой миллисекунды 207Р связанного 5)АР+ восстанавливается до 5)АРН в соответствии с положением быстро устанавливающегося равновесия между Е.й)АР+.Лактат и Е.5)АРН.Пируват. По мере высвобождения пирувата равновесие смещается в сторону образования продуктов, так что восстанавливаются все четыре связанные молекулы НАР+. Затем происходит более медленное отщепление 5)АРН, ГЛАВА 1т являющееся лимитирующей стадией в стационарном состоянии: Быстра медленна Е.МАО+.Лактат н Е.МАОН.Пируват Пируват Самая медленная стедня -дее Е.МАРН (12.9) МАПН Такое поведение можно по ошибке объяснить тем, что реакционной способностью обладает половина активных центров в молекуле, однако все четыре центра, по-видимому, являются независимыми [6, 41, 43].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
