Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 59
Текст из файла (страница 59)
Механизм корректирования при репликации ДНК должен несколько отличаться от механизма, используемого в случае аминоацил-тРНК вЂ” синтетаз: для выполнения своей функции в процессе биосинтеза ДНК-полимераза должна обладать способностью связывать все четыре дезоксинуклеотида, следовательно, она не может иметь специальный центр связывания для ошибочного основания (как, например, валил-тРНК вЂ” синтетаза, имеющая центр связывания для треонина), Нарушения первичной структуры ДНК могут быть обусловлены не только ошибками в работе синтезирующего аппарата; они возникают под действием рентгеновского излучения и ультрафиолетового света, в результате химической модификации оснований, В этих случаях ошибка исправляется с помощью механизма вырезания дефектного участка, замещения его при участии полимеразы и сшивания концов цепи ДНК-лигазой [6].
Ошибочно включенное основание распознается благодаря тому, что оно химически отличается от четырех обычно присутствующих в ДНК оснований. Имеется система, способная выщеплять остатки дезоксиуридина, ошибочно включенные вместо тимидина [!2], Здесь можно провести аналогию с распознаванием изолейцииа и валина при синтезе белка, поскольку урацил отличается от тимина тем, что последний содержит метильную группу. О О Тииии Ураиил Урацил удаляется из молекулы ДНК с помощью урацилглико. зидазы, которая отшепляет это основание от сахарного кольца. Механизм действия данного фермента аналогичен механизму действия изолейцил-тРНК вЂ” синтетазы, гидролизуюшей Ъ'артРНКне.
В обоих случаях гидролитический центр слишком мал, чтобы вместить субстрат, содержащий дополнительную метильную группу, благодаря чему этот субстрат остается неповрежденным. Коррекция при синтезе ДНК осуществляется СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИО!гНАЯ СПОСОБНОСТЬ З41 Таблица 11.1 Корреляция между частотой мутации н экзоиуклеазиой актнвностьга ДНК-полнмеразы фага Т4 [111 Штамм Количества гиироливоввиваго дТТР Феиатии Количества ввлючеиваго !ТМР Высокая частота мутаций То же Дикий тип Низкая частота мутаций то же сбб 0,005 сэб 74О 1.42 1.141 0,01 0,04 1,6 13 отдельным ферментом, так как ошибку можно исправить по завершении полимеризации.
Поскольку в случае синтеза белков такая роскошь непозволительна, гидролитическая функция возлагается на синтетазу, так что исправление ошибки должно произойти до того, как неправильно ацилированная тРНК покинет этот фермент [!3]. 3. «Кинетическое корректирование» Основное условие функционирования корректирующего механизма состоит в том, что в ходе реакции должно образовываться легко гидролизуюшееся промежуточное соединение или продукт.
Корректирование осуществляется введением в реакционный путь ответвления, обеспечивающего гидролиз нежелательных соединений. Как мы видели, в реакции аминоацилирования тРНК с участием аминоацил-тРНК вЂ” синтетазы в этом процессе участвует особый гидролитнческий центр фермента, где гидролизуется неправильно ацилированная тРНК, а возможно, и предшественник аминоациладенилата. Хопфилд [14] предложил специфический химический меха низм, который в принципе может использоваться для коррекции, — кинетическое корректиро-ание. Отличительной чертой этого механизма является отсутствие у фермента гидролитического центра; нежелательные промежуточные соединения диффуидируют в раствор, где подвергаются неферментатнвному гидро- лизу.
Принципы действия кинетическогокорректирования можно проиллюстрировать, рассмотрев гипотетический процесс аминоацилирования тРНК [схема (11.16)] (хотя, как было показано выше, в этом случае на самом деле имеет место не кинетическое 342 ГЛАВА !! корректирование, а механизм «двойного сита» с участием осо- бого гидролитического центра): Атп гг; ЕАА ЕАА АМР АА-тРНК ф., (11.16) А ЯА АМА АА АМР КАИН« При гидролизе АТР образуется высокоэнергетическое промежуточное соединение — аминоациладенилат. Фермент-содержащее промежуточное соединение может либо реагировать с тРНК с образованием продуктов, либо диффундировать в раствор и гидролизоваться.
Если имеет место кинетическое корректирование, ошибочное промежуточное соединение (например, комплекс валиладенилата с изолейцил-тРНК вЂ” синтетазой) диффундирует в раствор и гидролизуется быстрее, чем успевает прореагировать с образованием продуктов, т. е. й,«й 4. Для «правильного» промежуточного соединения п4 ) й 4 и имеет место образование продуктов.
Следовательно, более прочное связывание специфического субстрата используется дважды: первый раз при связывании субстрата с образованием комплекса Михаэлиса и второй — при связывании промежуточного соединения. Таким образом, если избирательность для первой стадии обозначить через ), то при условии, что для второй стадии она может достичь того же значения, мы получаем в итоге избирательность )ч. Однако чтобы избирательность на второй стадии достигла максимального значения, 1, для правильного субстрата й» должно быть меньше й 4, так что эффективность его образования будет низкой.
Эти ограничения не распространяются на механизмы двойного сита (рис. 1!А), поскольку пз-за наличия у фермента отдельного гидролитического центра структурное различие между двумя субстратами может использоваться на двух этапах. Так, например, при удалении валина с помощью изолейцил-тРНК вЂ” синтетазы преимущественное связывание изолейцина (а не валина) с центром аминоацилирования обусловливается тем, что изолейцин больше по размерам, чем валин. С другой стороны, благодаря меньшим размерам валин легче связывается с центром, где происходит деградация, связывание же изолейцина с этим центром стерически затруднено.
В механизме кинетического корректирования различия между двумя субстратами также используются дважды. Пока четких данных о выполнимости этого механизма нет, однако в принципе он весьма интересен и правдоподобен. Глава СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ В этой главе мы рассмотрим механизм действия большинства ферментов, кристаллическая структура которых установлена с высоким разрешением.
Особое внимание уделено вопросу о том, как совместное использование данных кинетических и структурных исследований позволяет достаточно полно описать механизм реакций, а также тому, что дало изучение 4ерментативного катализа для развития представлений о механизме химического катализа. Кроме того, в этой главе рассмотрены некоторые экспериментальные подходы, используемые в энзимологии. К сожалению, мы не касаемся здесь многих весьма интересных по своим свойствам ферментов, поскольку их кристаллическая структура все еше не установлена. Охватить в такой небольшой по объему книге все ферменты невозможно — их число превышает 1500,— и мы включили в данную главу только те из них, для которых можно связать трехмерную структуру с механизмом действия фермента.
Детали механизма действия большинства этих ферментов более или менее известны, Установлено, например, наличие и положение каталитических групп и последовательность химических преврашений в ходе реакции (хотя и не для всех случаев). Лучше всего изучены реакции, протекаюшие с образованием промежуточных соединений, которые можно выделить и охарактеризовать, Это не только дает представление о механизме химических преврашений, но и позволяет сразу получить важную информацию о положении субстрата относительно каталитических групп фермента.
Основной задачей структурного исследования является определение структуры фермент-субстратного комплекса, Без этого невозможно уяснить себе детали ферментативного процесса (например, определить, деформируются ли в ходе реакции фермент и субстрат) и точно установить положение субстрата относительно каталитических групп. Сама по себе структура фер- мента дает только основу, позволяюшую строить различные ги.
СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 345 потезы. К сожалению, как уже отмечалось в гл. 1, установить структуру продуктивных комплексов между ферментом и субстратом, как правило, не удается, а потому приходится использовать соединения, являющиеся аналогами субстратов, и прибегать к построению моделей. Недостаток данного подхода состоит в том, что можно не заметить такие эффекты, как напряжения и деформации. Иногда (например, в случае рибонуклеазы) структура аналога очень близка к структуре природного субстрата. В редких случаях (для трипсина и триозофосфатизомеразы) положение равновесия между субстратом и продуктом таково, что оно позволяет установить структуру продуктивного комплекса.
Очень важно иметь в виду следующее. Интерпретируя свои экспериментальные данные, исследователи нередко переоценивают их надежность и делают необоснованные выводы. Так, например, при анализе рентгеност( ктурных данных один исследователь может придавать большое значение каким-то изменениям на карте электронной плотности, а другой рассматривать их как артефакт. Наихудшие интерпретаторы из всех — это те, кто интерпретируют интерпретацию других. В подготовке данной главы существенную помощь мне оказали мои коллеги, позволившие привести свои неопубликованные данные. В связи с этим хотел бы выразить благодарность следующим ученым (их фамилии приведены в алфавитном порядке): Брендену С.-И.,Дутлеру Х.
и Плэппу Б. (алкогольдегидрогеназа); Байсекеру Г. и Уонакотту А. (глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеназа); Петско Г. (эластаза); Андреевой Н. С., Антонову В. К, и Гофману Т. (пепсин); Ноулсу Р. и Филлипсу Д. (триозофосфатизомераза); Уотсону Х. (фосфоглицеромутаза). А. Дегидрогеназы Дегидрогеназы, которые мы рассмотрим в данном разделе, катализируют окисление спиртов до карбонильных соединений В роли коферментов для них выступают либо МАО+, либо МАОР+. Комплекс фсрмснта и кофермента называется аолоферментоле тогда как свободный фермент именуется апоферментом. Некоторые дегидрогеназы специфичны лишь к одному из этих коферментов, когда как другие используют оба. Реакции, катализируемые дегидрогеназами, легко обратимы, так что карбонильные соединения могут быть легко восстановлены с помощью МАРН или МАРРН.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
