Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 55
Текст из файла (страница 55)
1) 128— 3!). Каталитическую активность химотрипсина можно подавить Рис. !0.10. Изменение конформации гексонииазы, индуцируемое присоединением глюкозы. Сплошная линия — а углеродный полипептидный остов изофермента А, закристаллизованного в присутствии глюкозы. Пунктирная линия — полипептидный остов той части иэофермента В, которая имеет другую структуру при иристаллиэации в отсутствие глюиоэы.
(Веппеп 'тг'. 3., 81еця Т. А., неопубликованные данные; Ребп. Ргос. АЬэ1г., 1977.) с помощью химического превращения нуклеофильного Бег-195 в дегидроаланин путем удаления гидроксильной группы и атома водорода. В остальном структура ангидрофермента остается прежней, и его можно использовать для изучения связывания субстрата.
Четко показано, что гидролнз пептидов протекает по механизму деформации [32). Кристаллографические данные указывают на наличие центра связывания для уходящей группы пептидного субстрата. Величина й г/Км для гидролиза АсРЬе-ХНз, АсРЬе61у-МНе и АсРЬеА!а-МНз значительно возрастает по мере увеличения размера уходящей группы, пока она не займет весь центр связывания (табл. 10.1), однако это увеличение всецело обусловлено увеличением й„ь величина же Км ТЕОРИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА 32! остается постоянной. Указания на присоединение А!аХНА или О1уХН, и ферменту в ходе обратной Реакции (атака уходящей аминогруппой АсРйе-химотрипсина) отсутствуют, поскольку кинетики с насыщением не наблюдается.
Эти группы реагируют значительно быстрее аммиака (для 1чН, й.,~/Км = 8 М-'с-', а дЛя 61у)чН~ И А!ао)Нз Эта ВЕЛИЧИНа раВНа 2000 М-' С-' И 5000 М-'с-' соответственно) [32). Энергия связывания остатков аланина и глицина используется для уменьшения энергии активации стадии химического превращения. Это не связано с эффектом индуцированного соответствия, поскольку структура кристаллического трипсина идентична структуре трипсина (и ангидротрипсина, если не принимать в расчет отсутствия в нем гидроксильной группы у 3ег-195) в кристаллическом комплексе с панкреатическим ингибитором трипсина (разрешение 1,4— 1,5 А). Связывание субстрата также, по-видимому, не сопровождается его деформацией. Рентгеноструктурные исследования комплекса трипсина и ингибитора осложняются деформацией ингибитора в отсутствие фермента 133), однако исследования методом ЯМР присоединения небольших субстратов к химотрипсину указывают на отсутствие деформации этих субстратов 1341.
Использование энергии связывания уходящей группы, повидимому, может рассматриваться как пример стабилизации переходного состояния, При связывании происходит лишь небольшая деформация фермента или субстрата (возможно, эта деформация и вообще отсутствует), однако уходящая группа не вполне соответствует своему центру связывания до тех пор, пока не образуется переходное состояние.
4. Специфическая сольватация переходного состояния— роль полипептидного остова. Рентгеноструктурный анализ позволил установить очень интересную особенность сериновых протеаз: ХН-группы белка служат сольватной оболочкой для переходного состояния рсакции. Это приводит к фундаментальному различию между простыми химическими реакциями в растворе и реакциями, каталнзируемыми ферментами. Единственный тип ориентации, который необходимо рассматривать для реакций в растворе, — это взаимная ориентация реагентов, поскольку растворитель создает сольватную оболочку вокруг любого образующегося заряда.
Лля ферментативной же реакции характерны определенные стереохимические отношения между реагирующими группами и группами, создающими сольватную оболочку и являющимися частью этой же молекулы фермента (рис. !О.1!). Очень важную роль при деформации и, следовательно, в обеспечении специфичности играют водородные связи, поскольку их энергия сильно зависит от расстояния (гл. 9). Особая роль в этих процессах принадлежит полипептидному ГЛАВА 1Е 322 остову,— жесткое расположение групп делает возможным ускорение катализа за счет напряжения в результате ослабления водородных связей с субстратом и образования более прочных связей с переходным состоянием. Высказывалось предположение, что в случае химотрипсина и трипсина карбонильный кислород подвергающейся химическому превращению амидной или эфирной группы субстрата, располагаясь между )чН-группами Бег-195 и 6!у-193 полипептидного остова, образует прочную водородную связь с Бег-195 (гл.
1, а также гл. 12, равд. Б.1). Рис. 1Ц11. Геометрические ограничения при ферментативном катализе, возникающие вследствие того, что катализатор (К) и сольватнрующие группы 1ХН) нвляются составной частью фермента. Зачерненные конусы показывают допустимые углы орбитального перекрывания при образовании водородных связей; б — межатомное расстояние. Слева: взаимодействие между молекулой катализатора К и субстратом приводит к образованию отрицательного заряда, вокруг которого образуется сольватная оболочка нз молекул воды. Справа: расстояние между катализатором и донорами водородных связей фиксировано в связи с тем, что они являются частью фермента [2].
Связь с 61у-!93 слабая, однако по мере увеличения длины двойной связи между атомами углерода и кислорода в ходе реакции и превращения ее в одинарную связь между атомом кислорода и 61у-193 становится достаточно прочной [32[. По. строение моделей для субтилизина приводит к аналогичному„ хотя и отличающемуся в деталях механизму [35]. Изначально карбонильный кислород не располагается между двумя МН-группами в фермент-субстратном комплексе, а занимает это положение по мере образования тетраэдрического промежуточного соединения.
Предполагается также, что водородная связь между Х-ациламиногруппой субстрата и Яег-214 образуется только в тетраэдрическом промежуточном соединении. Стоит отметить, что специфичность образования водородных связей между ферментом и субстратом определяется в значительной степени длиной связи, а не взаимным расположением участвующих в ее образовании атомов, поскольку, как говорилось в предыдущей главе, энергия водородной связи сильно ТЕОРИИ ФЕРМЕНТАТИВИОГО КАТАЛИЗА ззз зависит от расстояния, но очень слабо изменяется при отклонении от линейного расположения атомов [2]. Механизм действия сериновых протеаз очень хорошо иллюстрирует смысл концепции стабилизации переходного состояния.
Примеры реализации механизмов деформации и индуцированного соответствия обсуждаются в гл. !2 (последний механизм рассмотрен на примере функционирования карбоксипептидазы, папаииа и глюкоза-6-фосфат — изомеразы, а напряжение — на примере папаина). 6. Природа напряжения. Напряжение или деформация? Хотя в некоторых случаях напряжение представляет собой истинную деформацию субстрата, зачастую оно вообще не сопровождается искажением структуры последнего. Такая ситуация возникает либо в том случае, когда между субстратом и ферментом имеются неблагоприятные взаимодействия, устраняющиеся в переходном состоянии, либо когда при образовании переходного состояния возникает дополнительное взаимодействие, не реализующееся в фермент-субстратном комплексе.
В обоих случаях существуют силы, изменяющие структуру субстрата, с тем чтобы приблизить ее к структуре переходного состояния. Поскольку нековалентные взаимодействия довольно слабые (за исключением вандерваальсовых сил отталкивания), а ферменты и субстраты — достаточно гибкие молекулы, трудно ожидать, что взаимодействие фермента с субстратом приведет к деформации последнего, Может иметь место лишь поворот групп субстрата относительно простых связей (как, например, при конформационных изменениях субстратов лизоцима), растяжение же этих связей или их деформация вряд ли возможны, поскольку это требует больших энергетических затрат.
Энергии связывания вполне достаточно для деформации субстрата, однако для использования этой энергии необходимо, чтобы ее значение существенно изменялось на очень коротком расстоянии, т. е. чтобы образовалась сильная связь. На основании энергетических расчетов Левитт пришел к следующему выводу: «Небольшие изменения конформации субстрата, приводящие к существенным изменениям энергии напряжения, не могут быть вызваны связыванием с ферментом» [8, 36[. Кроме того, он предположил, что самые большие по величине силы, которые принимают участие в деформации субстрата, не превышают )2кДж (моль А)-' [3 ккал (моль А)-'[, что приводит к смещению атомов на ! А.
Деформация может иметь место лишь в предельных случаях, и обычно напряжение определяется тонко 324 гллвл и сбалансированным соотношением между выгодными и невыгодными взаимодействиями. Более вероятно, что деформируется не субстрат, а фермент, поскольку ферменты имеют менеежесткую структуру. Действительно, в данной главе приведено множество примеров деформации фермента при связывании субстрата.
Возможно, некоторые из этих деформаций представляют собой неблагоприятное следствие гибкости белков и невозможности сформировать активный центр, в точности комплементарный данному субстрату. Легкая доступность активного центра может быть обеспечена низким значением энергии конформационного перехода, при котором определенная часть активного центра сближается с субстратом (как в случае пептидов и карбоксилпептидазы, а также НАР~ и дегидрогеназ, гл. ) 2).
В физике и технике термин «деформация» (з(га(п) имеет вполне определенный смысл. Подразумевается, что структура объекта физически искажена. Другой, близкий термин «напряжение» (з(гезз) означает, что объект находится в напряженном состоянии, но не разрушен. Используя эти точные физические термины, можно сказать, что в фермент-субстратном комплексе ф рмент, как правило, деформирован, тогда как субстрат находится в состоянии напряжения. Деформация и напряжение в ферментах могут вызываться различными причинами. Как мы виделн в данной главе и увидим ниже (гл. !2), деформация и напряжение включают два процесса: дестабилизацию субстрата и стабилизацию переходного состояния. Дестабилизация субстрата может сопровождаться пространственной деформацией, когда между ферментом и субстратом возникают неблагоприятные взаимодействия (пролинрацемаза, лизоцим), десольватацией фермента (удаление двух молекул воды от карбоксильной группы Азр-52 в лизоциме), десольватацией субстрата (например, пептида, теряющего какое-то количество молекул связанной воды).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
