Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 51
Текст из файла (страница 51)
гл. 1). Аналог переходного состояния 1, в котором лактоновое кольцо имитирует переходный комплекс, подобный карбоний-иону (П), прочно связывается с лизоцимом с Км„= 8,3 10-'М (7). СН20Н О вЂ” С вЂ” (А2Р-52) Н (ХАО)2— НН ! СН Сравним эту величину с константами диссоциации для ЯАС2 и МАС2-1)АМ-1)А2э-1)АС (связывающимися с подцентрами АВСЩ, которые равны 1О-а и 8 1О-'М соответственно (7,8). Стократное увеличение прочности связывания переходного состояния субстрата частично может быть обусловлено электростатическим взаимодействием отрицательно заряженного Азр-82 с положительным зарядом карбонильного атома углерода этого лактона. 2 сн,он НО О О НО НО ННАо 1Ч 7Сарбоний-ЧОМ („ софа" ) )ЧНАо 1Н оаил2ои 1 софа ) СН,ОН О ОК НО НО ХНАс 2 Ч Пиракооид ~ииросло") СН,ОН О О ОН Е)АО),— О )чн ) С-О СН2 11 ТЕОРИИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА Еще более поразительный эффект наблюдается при связывании лактона (Ш) с р-Х-ацетил-П-глюкозаминидазой.
Константа диссоциации комплекса равна 5.10-' М, что в 4000 раз меньше Км для пиранозидного субстрата (2 10 — з М) [9). б. Пролинрацемаза При рацемизации пролина(Ч1) хиральный атом углерода должен на некоторой стадии стать тригональным. В соответствии с этим соединения ЧП и ЧШ связываются в !60 раз прочнее пролина !10, 11]. Л О 141 О, — СО; Н ЧП! ЧП Ч1 в. Цитидиндезаминаза Константа диссоциации тетрагидроуридина (1Х) примерно в 10 000 раз меньше констант связывания продуктов реакции— уридина(Х) и аммиака. Вероятно, тетрагидроуридин напоминает промежуточное тетраэдрическое соединение Х1 !!2). О !! Х! К 1Х г.
Анализ результатов связывания аналогов переходного состояния субстрата Аналоги переходного состояния субстрата, которые были синтезированы до настоящего времени, позволили проанализировать ту часть каталитического процесса, которая связана с различием в комплементарности фермента переходному состоянию субстрата и исходному субстрату. В приведенных выше четырех примерах аналоги переходного состояния связываются в 10' — 104 раз прочнее самих субстратов.Это свидетельствуетоб эволюции ферментов в сторону структурной комплементарности ГЛАВА 1О зоа переходному состоянию субстрата, а также показывает, что величина й„4 может возрастать в 1О' †1 раз за счет увеличения Км. Принимая во внимание, что эти синтетические аналоги могли быть весьма далеки по структуре от переходного состояния, которое они моделировали, энергетический выигрыш от увеличения комплементарности между переходным состоянием субстрата и ферментом можно оценить по крайней мере в 20 кДж моль-' (5 ккал моль †').
В гл. 12 будет показано, что в центре связывания карбонильного кислорода субстрата сериновой протеазы недостает одной водородной связи. Эта связь образуется во время реакции при образовании переходного состояния, и подобное увеличение комплементарности дает выигрыш в энергии 20 — 25 кДж моль-' (5 — 6 ккал моль-'). д. Возможные ошибки при интерпретации данных, полученных при использовании аналогов переходного состояния субстрата Изучение комплементарности фермента переходному состоянию субстрата с использованием аналогов переходного состояния субстрата может быть осложнено наличием «лишних» связей с группами, введенными в молекулу аналога. В гл.
9 было показано, что связывание небольшой группы дает существенный вклад в энергию связывания, когда в процесс вовлекается специфический для этой группы центр связывания. Например, вклад метиленовой группы в энергию связывания может состав. лять 12 кДж моль-' (3 ккал моль-'), а вклад гидроксильной группы за счет образования водородной связи — 25 кДж моль-' (6 ккал моль-'). Даже если специфические центры связывания не затрагиваются, большой энергетический вклад могут дать гидрофобные эффекты: замена в фенильном кольце ацетнльной группы на атом С1 приводит к 50-кратному увеличению прочности связывания этого кольца в гидрофобном кармане химотрипсина [!3].
Затруднения при интерпретации данных (обусловленные хелатным эффектом) возникают и в тех случаях, когда используются аналоги переходных состояний для мультисубстратных ре. акций. Как отмечалось в предыдущей главе, полидентатные лиганды (например, ЭДТА) в отличие от монодентатных прочно связывают ионы металлов. Это различие в свойствах обусловлено энтропийным фактором; связывание шести монодентатных лигандов приводит к потере шести наборов поступательных и вращательных степеней свободы. То же самое относится и к связыванию ферментом «мультисубстратных» или «мультипро. дуктных» аналогов. Если А и В присоединяются к ферменту независимо и рядом друг с другом и процесс характеризуется энергией связывания Гиббса х и д килоджоулей соответственно, ТЕОРИИ ФЕРМЕНТАТИВИОГО КАТАЛИЗА а комплекс А — В связывается с ферментом аналогичным обра.
зом, то свободная энергия связывания будет равна Аб„, =х+ у+ 8, (10. 11) где Я вЂ” отрицательная величина, поскольку связывание А — В сопровождается потерей только одного набора степеней свободы в отличие от связывания А и В, когда теряется два набора. Даже если не принимать во внимание эффекты подобного рода, связывание мультисубстратного аналога должно быть очень прочным за счет комплементарности фермнета переходному состоянию субстрата.
Например, соединение Х11 связывается аспартаткарбамоилтрансферазой очень прочно: Кю = 2,7 10 ' М. Однако это значение равно просто произведению констант диссоциации комплексов фермента с сукцинатом и карбамоилфосфатом (9 10 †' Х 2,7 10 †' М вЂ” з), которые близки по структуре к составным частям соединения Х11, имитирующего переходное состояние реакции 114]. )ЧН СН,РО~ Сн,— СН С !1 СО2 СО2 О Хц РО~з О ,г 2, АадбаМОИЛ1Н вЂ” 7НГ Ф"Ф' СО2 СОЗ 4сюгртагп Б. Эволюция фермента в сторону увеличения максимальной скорости реакции: сильное связывание переходного состояния субстрата — слабое связывание самого субстрата В предыдущем разделе было показано, что ферменты эволюционировали в сторону более сильного связывания переходных состояний субстратов, а не самих субстратов.
Ниже будет зоб ГЛАВА )О Своростьб) с-1 аса( км, и 1О !О 10 1О 1О 10 1 1 10 10а 103 10е 1Оз 1Ов 1 9 90 500 909 990 999 а) умозрительные пропессы: а) фермент вводюин. овнрует в сторону обесиечеин» комплементарности переходному состоянию субстрата н манснмально высо кого значениЯ отноюеииа асд(/КМ. б) пРи сохРанении максимально высокого значения асд(/КМ фермент вволюпионнрует в сторону увеличения КМ. Значеияя величин асд(/КМ н (3) выбраны произвольно. б) Число молей продукта, образующнхс» на моль фермента в 1 с. отношения. В табл. 1О.З приведены значения скорости, рассчи. танные для различных значений й„( и Км при постоянном отношении )зса(/Км.
Из этой таблицы видно, что максимальные скорости достигаются при Км ) [Я, т. е. при высоких значениях Км. Таким образом, ферменты должны эволюционировать в сторону слабого связывания субстратов. [. Принцип максимизации Км при постоянном й ..(/Км [2] Этот принцип опровергает широко распространенное мнение, что необходимым условием протекания ферментативной реакции является наличие сильного связывания фермента с субстратом показано, что слабое связывание субстратов является каталити.
чески выгодным. Хотя комплементарность фермента переходному состоянию субстрата максимизирует й, (/Км, это не означает, что макси- мальной является и суммарная скорость реакции. Дело в том, что максимальная скорость реакции при данной концентрации субстрата зависит от величин Всат и Км как таковых, а не от их Таблица 10.8 Хараитер изменения параметров Км в а, ( в результате еволюаии )рермеита, протеиаюизеа при постоянстве значении "ся(ТКм и [$!М (Аса(гКм = М с ', [8] 10 М) ТЕОРИИ ФИРАГИНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА или низкое значение Км. Рассмотрим еще два довода в пользу важности для катализа высоких значений г(м.
Физические причины этого фактора иллюстрируются графически. а. Графическая иллюстрация важности для катализа высоких значений Км Предположим, что концентрация субстрата больше Км для данной реакции (рис. !0,3, А). Фермент-субстратный комплекс Рис. 10.3. Два случая эволюции фермента. Переходные состояния субстрата связываются с ферментом одинаково хорошо, ио в случае А сам субстрат связывается прочно, тогда как в случае Б в результате эволюции фермента— слабо (концентрация субстрата в обоих случаях одинакова). А.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
