Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 72
Текст из файла (страница 72)
Константа равновесия для ироцесса взаимопревращения негндратированных кетоформ равна поэтому 330, причем иреобладающсз формой является негидратированная кетоформа диоксягцстоифосфата (Тгеойат О. Гс., Мсмцггау С. Н., Рояаои С. 1., В!осиещ. Л 114, 19 (!969); Пеуиомэ 5. )., Уа!ез !1. %, Рокзоц С !., В!остена Л, 122, 285 (197!)]. стрикткра н механизм данствия отдельных еврмвнтов 405 а.
Обмен протонов со средой: ендиол в качестве промежуточного соединения [233, 238 — 240) Первые эксперименты, проведенные в водных растворах, обогащенных дейтерием или тритием, показали, что в продукты реакций, катализируемых маннозо-б-фосфат-, глюкозо-6-фосфат-, рибозо-5-фосфат. и триозофосфатизомеразами, стереоспецифически включается до одного моля изотопа. 0 Н .О ч'С Н вЂ” С вЂ” ОН ю о,о Н вЂ” С вЂ” ОН » С=О ! и й (12.54) Всегда считалось, что результаты этих экспериментов исключают возможность прямого переноса гидрид-иона и указывают на образование протонов, которые могут обмениваться со средой, Было высказано предположение, что в качестве промежуточного соединения образуется ендиол КС (ОН) =С(ОН) Н [238). б.
Выявление внутримолекулярного переноса протона: цие-ендиол и участие в переносе только основания [234] Следующим достижением было выявление того факта, что помимо обмена протона со средой, происходит внутримолекулярный перенос водорода (трития) между двумя углеродными атомами: Н Н вЂ” С вЂ” ОН е, нро С=О + и Н ! т — С вЂ” ОН ! С=О ! й 'С~ Н О Т вЂ” С вЂ” ОН й (! 2.55) !иекоторое количество) Проще всего объяснить это явление следующим образом.
Тритий, связанный с С-2-атомом субстрата, переносится на катализирующее основание; некоторое количество трития, прежде чем перейти на С-1-углеродный атом, обменивается с протонами воды, а остальная часть атомов включается в положение С-1 до того, как успеет высвободиться в раствор. Из этого можно сделать два важных вывода: 1. Перенос осуществляется только основанием (если, скажем, основание «отбирало» бы протон от атома С-2, а отдельный остаток кислоты переносил свой протон на С-1, то никакого переноса не происходило бы).
ГЛАВА гт 4ОВ 2. Поскольку в переносе протона участвует только основание, протон должен вновь присоединиться к ендиолу с той же стороны, с которой был удален. Из рассмотрения стереохимии продуктов следует, что ендиол является цис-изомером (гл.2, равд. В). На этом основании Роуз предложил следую!ций механизм [228, 2481: т с — Он в:-' ! .у, — "' в — т ! С вЂ” ОН С вЂ” ОН ! ! С=О В: Т вЂ” С вЂ” ОН ! Т' (12.56) С вЂ” ОН !! С вЂ” ОН ! С=О В: Н вЂ” С вЂ” ОН га лг ~~ йт В ч Рис.
!2.!3. Энергетический профиль реакций, катализируемых триозофосфатизомеразой [244]. 3 — диоксиацетонфосфат, Š— ендиол, Р— глицеральдегид. 3-фосфат. Штрих-пунктирная линия относится к случаю, когда частота со. ударений определяется диффузией. Энергетические барьеры для бимолекуляриых реакций рассчитаны дчя концентрации реагентов 40 мкМ, что примерно соопзетстаует концентрации диоксиацетонфосфата в клетке.
Отметим, что Высота всех знергетических барьеров такая же (или немного больше), нак и в случае ассоциации фермента и субстрата. Дальнейшее увеличение скорости в результате зволюции фермента невозможно. Этот фермент полностью удовлетворяет требованиям, предъявляемым к зволюционно совершенному ферменту (гл. !О, разд. Б.2): значение АгмгКм близко к лимитпруемому диффузией пределу, а Км много больше !5).
Основание В в механизме действия триозофосфатизомеразы представляет собой карбоксильную группу 61ц-166. Роль Н(з-96 до конца не выяснена: его ионизация не выявляется из рН-зависимостн гтса!. (График зависимости йсаг!Км от рН для СТРУКТУРА Н МЕХАНИЗМ ДЬНСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 407 фермента из мышц цыпленка представляет собой колоколообразную кривую, характеризующуюся рК. = 6 и 9, тогда как рН-зависимость й,м изображается сигмоидной кривой, в которой проявляется только более низкое значение рК, [241]. рН-зависимость й„~/Км для фермента, выделенного из дрожжей, также описывается сигмоидной кривой, отражающей ионизацию группы с более низким значением рК. [242].
рН-зависимость скорости химической модификации 01п-165 показывает, что рК. этого остатка равен 3,9 [242, 243]; см. гл. 5, равд. Б.2.в н гл. 7, равд. Ж ) в, Построение энергетического профиля для реакции [244] Самое последнее достижение в исследовании указанных выше реакций с применением радиоактивных изотопов состоит в исчерпывающем анализе обмена тритием между водой и продуктом и остающимся субстратом в стационарных условиях, обмена тритием между меченным тритием субстратом и раствором и продуктом, а также первичных кинетических изотопных эффектов для скорости реакции. Из этих данных удалось определить все константы скорости для механизма (12.56) и построить энергетический профиль для реакции, катализируемой триозофосфатизомеразой (рис. 12.13).
3. Глюкозо-6-фосфат — изомераза [228, 229] Другой гликолитический фермент, Р-глюкозо-6-фосфат — изомераза, катализирует взаимопревращение между глюкозо-6-фосфатом и фруктово-6-фосфатом. Кристаллическая структура фермента, выделенного из мышцы свиньи, была установлена с разрешением 3,5 А. Фермент является симметричным димером с мол. весом 120000 [245]. Последовательность реакций, катализируемых глюкозо-6-фосфат — изомеразой, более сложна, чем в случае триозофосфатизомеразы.
В растворе сахара существует в виде циклических полуацеталей, представляющихсобой равновесную смесь а- и р-аномеров (глюкозо-6-фосфат на 38% представлен а-формой и на 62'/о — [)-формой; для фруктово-6-фосфата эти величины составляют 20 и 80Р~Р соответственно) [228]. Субстрат, участвующий в реакции изомеризации, находится в раскрытой форме [246 — 248], В растворе эта форма присутствует лишь в очень небольшом количестве, и, следовательно, первая стадия реакции представляет собой катализируемое ферментом раскрытие кольца.
м-Аномер реагирует быстрее р-аномера, однако оба они участвуют и образуются в ходе реакции. ГЛАВА 12 сно А О,РОН,С в О,РОН,С = но-(- н н —;-он он ' он Т (12.57) СН,ОРО вой-глюкоза-6-фоафап р-э-олюкоао-6-фовфат ОвРОНГС О ОН СНгОН СНО ОН Он ОН СН20РОЗ р-2-фруктово-6фовфат в ОАРОН2С О СН,ОН О2.58) НО ОН ОН и-о- фувуктооо-6фоофат Реакция протекает следующим образом (228, 234): во-б-Р аУ-б-Р н н о н он н ~ он à — с с С=О и' ! он и он я аао-Яабаол [~ (1269) Ф „г ..„ ,С 6с-б-Р и ! он Н 6Р-б-Р СТРУКТУРА Н МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕ!1ТОВ 409 Фермент не преврашает маннозо-6-фосфат в фруктозо-6-фосфат, а катализирует раскрытие кольца, в результате чего а-аномер переходит в 6-аномер со скоростью, примерно равной скорости изомеризации глюкозо-6-фосфата [249[.
Производные маннозы отличаются от производных глюкозы положением атома водорода и ОН-групп, связанных с С-2-атомом. Вследствие этого, вероятно, атом водорода вытесняется из основания, которое катализирует образование Час-ендиола в ходе реакции (!2.59). Скорость реакции изомеризации зависит от присутствия оснбвной группы с рК, = 6,8 и кислой группы с рК.
= 9,3 в свободном ферменте [250). Исходя из данных по теплотам изомеризации было высказано предположение, что эти значения рК, относятся к имидазольной и аммонийной боковым цепям остатков гистидина и лизина соответственно [250]. Остаток глутаминовой кислоты модифицируется эпоксидом 1,2-ангидро-0-маннитол-6-фосфатом (гл. 7, разд. Ж) [251[. Все эти данные в совокупности с результатами кристаллографического анализа позволили сформулировать механизм действия фермента.
Интересно, что при этом аминокислотная последовательность глюкозо-6-фосфат — изомеразы все еше не установлена, и, следовательно, боковые цепи аминокислот не могут быть четко идентифицированы. сно ОзРСН2С но но н он он сн2 ОРО~ Р- Маннозо-6-фосфан '-О,РОН,С (12,60) н -Р-маннооо-о-фоофанс Кристаллическая структура комплекса между ферментом и эффективным ингибнтором арабинонат-5-фосфатом установлена ГЛАВА И 410 с-о-1 Н дт и (О 'н ОРО о Н-о он он н с-о я 0 н д: (О Н ОРОЭ Н В') С=О Н кд: / н о оаоа гр г а  — Н ОН В: С=О дь о н ;~И;< ОН ОН В~ ! о Н О ОРО ОН Рис. 12.!4. Механизм действия глюкоза-6-фесфат — изомеразы, осноаанный на данных рентгеноструктурного анализа 1252). с разрешением 3,5 А [252].
Это соединение сходно с промежу- точным соединением цис-ендиолом 1схема (12.61)) и связывает- ся в 1000 раз прочнее субстрата 1253). ОРОз ОРОз НО НО О НО (12.б1) ОН цип-Енес О ЯраЫнонт-5-фпс4ат СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЯСТВИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ 411 4. Фосфоглицеромутаза [254] 0-фосфоглицеромутаза катализирует взаимопревращение 2- и 3-0-фосфоглицерата [схема (!2.62) ].
Фермент, выделенный из мышцы, является димером с мол. весом 54 000. Кристаллическая структура фосфоглицеромутазы дрожжей была установлена с разрешением 3,5 м. Фермент является симметричным тетрамером с мол. весом ! 10 000 [255]. со Н вЂ” 1 — ОРО,'. сн,он 2РО со; ~=. н — с — он СниОРО1 ЗРО (12.62) В качестве активатора или инициатора в реакции участвует 2,3-дифосфоглицерат (2,30РС). Функция этого соединения состоит, по-видимому, в фосфорилировании боковой цепи гистидина с образованием каталитически активного фосфорилфермента. 2,3-дифосфоглицерат был выделен как в случае мышечной, так и дрожжевой фосфоглицеромутазы [256].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
