Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 36
Текст из файла (страница 36)
рН раствора можно очень резко изменить, смешав его с концентрированным буфером с высоким рН в кювете спектрофотометра, применяемого для регистрации в методе остановленной струи [12, 13]. Константу скорости деацилирования можно определить методом замещения профлавина или используя соединения, содержащие фурилакрилоиловую группу. Ацилферменты получают и 1п з1(н, смешав эфирный субстрат, ГЛАВА Г содержащий нитрофенильную группу, с избытком фермента в устройстве, применяющемся в методе остановленной струи [14]. Эти эксперименты показывают, что промежуточным соединением в реакции гидролиза эфиров является ацилфермент, который можно выделить при низких рН.
Константа скорости деацилирования ацилфермента имеет такое же значение, какое было получено из данных по стационарной кинетике, Из опытов по изучению реакции ацилирования следует, что промежуточное соединение образуется довольно быстро, в стехиометрическом соотношении 1: 1. Естественно, что ни в одном из этих экспериментов ие было показано, что ацилируется именно Яег-195. Окончательно этот вопрос был решен лишь при рентгенострукт рном анализе индолилакрилоил-химотрипсина (гл.
1) !15]. ывод об участии в ацилировании Бег-195 был подтвержден классическим путем, состоящим в необратимом ингибировании фермента эфирами фосфорной кислоты (например, диизопропилфторфосфатом) с последующим выделением фосфатсодержащего пептида после частичного гидролиза белка ]16, 17]. 2.
Выявление ацилфермента при гидролизе эфиров с помощью данных стационарной кинетики В предыдущем разделе было показано, что кинетические исследования с помощью метода оставленной струи дают возможность обнаружить накапливающиеся промежуточные соединения. Стационарная кинетика не позволяет прямо выявить эти соединения, она дает лишь косвенные данные. Окончательный ответ на вопрос зависит от результатов прямых измерений с привлечением данных предстационарной кинетики. Однако стационарная кинетика позволяет выявить ненаналлиеающиеся промежуточные соединения и, основываясь на данных тех эспериментов, когда накопление происходит, доказать их сушествование и выяснить природу. Для выявления промежуточных соединений с помощью стационарной кинетики необходимо, чтобы имело место накопление а) промежуточного соединения, способного взаимодействовать с акцептором (или желательнее с несколькими различными акцепторами), концентрация которого (или которых) может изме.
няться; б) общего для нескольких субстратов промежуточного соединения Š— й, образуемого субстратами, каждый из которых содержит фрагмент и, это промежуточное соединение должно обладать способностью взаимодействовать с различными акцепторами. Гидролиз эфиров (и амидов), катализируемый хнмотрипсином, удовлетворяет обоим требованиям.
Так, например, при КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 219 гидролизе и-нитрофенилового эфира ацетил-) -триптофана образуется ацилфермент, реагирующий с различными аминами, например с гидроксиламином, аланинамидом, гидразином и т. д., а также с такими спиртами, как метанол, давая гидроксамовую кислоту, дипептид, гидразид и метиловый эфир ацетнл-(.-триптофана соответственно. Аналогичный ацилфермент образуется при гидролизе фенилового, метилового, этилового и других эфиров аминокислот !а также при гидролизе амидов). Кинетические последствия, к которым приводит наличие общего промежуточного соединения, могут быть использованы для выявления его присутствия. таблица 7П Зиачеииа йсы длв катализируемого а-химотрипсииом гидролиза различных субстратов при рн 7,0 и 25 сС Проиаводиое Производные М-ацетил-Е-триатофана 0,025 27 28 30 Амид Этиловый эфир Метиловый эфир и-Нитрофеииловый эфир 7,3 О,! О,! 0,002 Ацилироваиие Деацилироваиие Е.фенилаланина Производные Аг ацетил 0,039 53 58 77 37 0,09 0,15 0,02 Ацилироваиие Деацилироваиие Амид Этиловый эфир Метиловый эфир а-Нитрофеииловый эфир е 79-бензоилелицина Производны Этиловый эфир 0,1 2,3 Метиловый эфир Изопропиловый эфир Изобутиловый эфир 0,14 0,05 0,17 2,4 2,3 2,4 0,43 0,5! 1,2 0,092 0,51 0,1 0,54 0,54 0,14 0,03 1 — тегпег В., Вопд и.
Р. М., Вепвег М. 1., 3 Апп Снеги, Зос., 86. 3674 (19641. 2 — Ерапв Ц, М.. 97пвоп 1. В.. 3. Ыо1, СЬет.. 238, 1716 (19631. 3 — (Укиатя А, Вмспетумгу, 9, 3383 09701. (Данные приведены х РН 7,0 на данных для рН 8,91 в вредположеннн, что рк =6.8.1 а всходя Холииоаый эфир 4-пиридииметиловый эфир и-Метоксифеииловый эфир Феииловцй эфир а-Нитрофеииловый эфир Дса1 с М' Лимитирующая стадса Км Нсгочинн мМ ~ данныха( В основном ацилироваиие То же Ацилироваиие В основном ацилироваиие Деацилироваиие ГЛАВА т а. Распад общего для нескольких субстратов промежуточного соединения и значения У~~- н Й~~» Если из нескольких субстратов образуется одно и то же промежуточное соединение и если его распад является лимитирующей стадией процесса, то гидролиз всех этих субстратов характеризуется одинаковой константой й„».
Этот феномен, обнаруженный Гутфройндом и Хаммондом в 1959 г, И8], наблюдался затем при исследовании многих серий эфирных субстратов химотрипсина (табл. 7.!). Для слабо активированных эфиров величина й„» уменьшается до значения, меньшего й,„ поскольку стадия, характеризуемая константой й,, становится частично лимитирующей [уравнение (7.1)]. В случае амидов й„» очень мала и стадия с константой й» является полностью лимитирующей. Однако наличие одинаковой константы й„» для ряда субстратов еще не доказывает того факта, что происходит накопление общего ковалентного промежуточного соединения, распад которого является лимитирующей стадией. Например, й,.» для гидролиза большого числа эфиров фосфорной кислоты, протекающего с участием щелочной фосфатазы, одинакова [19, 20].
Объяснялось это тем, что лимитирующей стадией для всех реакций является гидролиз фосфорилфермента. Однако теперь представляется более вероятным, что при щелочном рН дефосфорилирование происходит быстро [21], а лимитирующей сталией является высвобождение неорганического фосфата из комплекса фермент — продукт (Е.Р») [22, 23]. Наличие одинаковой константы й,.» для всех упомянутых реакций действительно обусловлено образованием одного и того же промежуточного соединения, однако оно не является ковалентным. б. Распределение промежуточного соединения между конкурирующими акцепторами Если образующееся промежуточное соединение может реагировать с различными акцепторами, то для его обнаружения можно использовать два подхода.
Первый подход состоит в определении соотношения, в котором образуются продукты. Например, гидролиз химотрипсином серии эфиров гиппуровой кислоты в растворе гидроксиламина ведет к образованию свободной гиппуровой кислоты и гиппурилгидроксамовой кислоты в постоянном соотношении (табл. 7.2). Неферментативный гидролиз в тех же условиях приводит к разному соотношению между продуктами [24, 25]. ин,он — »»СО»1НОН е+ ксоон' — ф ксо — е — н о йсо,н кннатичвскнв мвтоды и мкхаиизм двиствия фврмвнтов 22! Таблица 7.2 Соотногление между продуктамн катализируемого а-хнмотрипсином гндролиза Х-беизонлглииииовых афиров в 0,1 М растворе гидрокснламниа (24, 25) Оисиемииолив/Гииролив эфир в присутствии ~[!ермеите р ! б,б-б,а в отсутствие фермеитв рн !2 Метнловый Изопропиловый Гомохолнновый 4-пнридинметнло- вый 0,37 0,38 0,37 0,37 0,99 0,29 !,73 3,03 а',(н,о) Кз 82 ! — — Есо,н Е+ кооок' и==~ Е.ЕСООЙ' м о ЙСΠ— Š— ~ а,!к! (7,3) к'ОН вЂ” ~ ЕСО-!У Применение обычного подхода, используемого для реакций, катализируемых химотрипсином [26[, дает следующие выражения для Йсв! и )(и ( йл [нзо[+ й, (йу) лм =оп ' ~ аз+ й, '[н,о[+ й, (йу) (7.4) Это четко указывает на наличие общего промежуточного соединения.
Второй подход состоит в измерении скорости образования продуктов гидролиза определенного субстрата при разных концентрациях акцептора. Это дает информацию о лимитирующей стадии процесса и о природе промежуточного соединения. Предположим, что лимитирующей стадией является образование ацилфермента, В таком случае, поскольку акцептор реагирует с ацилфер ментом после лимитирующей стадии, он не может увеличить скорость гидролиза эфира. Суммарная скорость образования продуктов будет такой, какпоказанона рис.
7.2. Если лимитирующей стадией является гидролиз ацилфермента, то акцептор будет увеличивать скорость этой реакции и, следовательно, суммарную скорость образования продуктов (рис. 7.3). Чтобы рассчитать кинетические параметры для распределения промежуточного соединения, можно воспользоваться схемой (7.3) (для простоты предполагается, что нуклеофил уу' не присоединяется к ферменту): ГЛАВА т ап 0,4 .аг аг О1 о аог ап4 а по о по ауп 1А1а МНВК', Й) Рнс 7,2. Каталнзнруемый хнмотрнпснном гндролнз н реакции трансацилнро. ванна лтрнметнламмонвйанвлндацетилфенилаланнна (АсР)геТМА) в присутствия А!аХНэ в различных конценграцнях. Значення Й„г для нсчезновення АсРЬеТМА н образования Аср)ге н АсРЬеА!аХНз получены нэ уравнення )7.3) прн Йэ = 0,604 с — ', Й~)НзО)=!44 с-' н Йг = 6340 М вЂ” 'с-' !!4).
поп 400 Х. гоп п а оп ап4 а по а по ауп Ел)а))нэЛ, Йг Рнс, 7,3. КаталнзнруемыА хнмотрнпснном гвдролнз н реакции трансацнлнро. ванна метнлового эфира ацетнлфеннлаланина (АсР)зеОМе) в присутстввн А)аХНз в различных концентрациях. Значения Й,м для всчезновення Аср)теОМе в образования АсР)ге н АсР)геА!аХНз получены нз уравнения 17.3) нрн Йэ = 2200 с-', Йэ [НзО) = !44 с-', Й, = 6340 М-'с-' )!4). КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕНСТВИЯ РГРМЕНТОВ Для реакции образования КСО2Н 8222 [Н20] Асиг Аз + Аз [нзо] + А, (л ) ' (7.5) а для образования КСО-гЧ Алаи(гу! А, + А,'[Н,О] + А, (7У) ' (7.6) Значение йсиг/Км для исчезновения КСО2К' получается делением суммы двух значений й„! [уравнения (7.5) и (7.6)] на Км и равно мз(г(з.
Напомним (гл, 3, равд. Е), что такое соотношение всегда справедливо для серии последовательных реакций, следующих за стадией равновесного связывания. Это дает еще один способ выявления промежуточного соединения. Если реак. ция с участием нуклеофилов включает прямую атаку комплекса Таблица 7Л Кинетические константы дли каталнзнруемого а-химотрипсином гндролиза об!ирои М-ацил-!саминокнслот при 25 'С, рн 7,8 н нонноа силе 0,1, полученные нэ опытов по определение соотношении между продуктами реакции (27) Амиио- кислоти «М, мм аз, с-~ а си! «З, мм Ацил Эфир Ацетил Ацетнл Бензовл Ацетил Бензоил Бензоил Ацетвл Бензоил Ацетил Ацетнл Ацетнл Хлорацетил Бензонл Ацетвл Ацетил Апетил Ас-С-А1а Беизонл Ацетнл Беизоил Беизонл Ас-С-!.ец Фуронл а!у О!у с!у Вц! В,1 А1а МЧа1 МЧа! Ча! Ча1 Ча! Ча! Ча! Мцеи Рье Рбе Рбе Рбе Туг ТУг Туг Туг Туг осн, ос н осн, ОСНл осн ос н оснз осн, осн ОС2Ни изо-ОСзНг осн, осн осн осн, ос н осн осн ОСиНи Осни ОС,Н, ОСН, осн О,! 09 0,051 0,31 1,41 0,32 0,069 5,08 2,45 0,173 0,152 0,096 0,127 0,064 !6,1 97,1 68,6 57,3 30,7 192 90,9 85,9 65,7 50 862 445 4,24 66,7 1,41 5,97 14,3 0,85 87,7 110 177 43 4.17 5,37 0,93 1,85 0,296 0,0349 0.663 0,018 0,022 0,0192 0,417 0,49 0,094 0,42 8,81 0,41 0,069 35,6 4,!6 0,98 0,55 0,178 0,32 0,09 103 796 265 176 45,8 5000 364 249 158 66,7 О,!4 0,11 1,17 1,68 1,52 0,6 5,93 5,93 0,2! 0,2! 0,21 0,2! 0,22 19,1 111 92,7 85 91,6 200 !21 !31 113 200 3380 823 5,78 417 1,79 5,97 100 1,45 500 398 327 108,8 5,84 34,4 7,63 7,!4 0,909 0,0524 17,2 0,0728 0,0638 0,0461 0,56 ГЛАВА Г Михаэлиса, как в реакции, представленной ниже, й, а/Км будет функцией концентрации А'.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
