Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 40
Текст из файла (страница 40)
Двухстадийные процессы связывания АТР и АРР, выявляемые методом остановленной струи [651 с регистрацией флуоресценции триптофана При низких концентрациях АТР связывается с Вг с кажу- шейся константой скорости второго порядка, равной ' гпп 4 гпп 0,0 ЕлтП, мм пп Рис. 7ЛО. Константы скорости процесса увеличения интенсивности флуорес. цепция фрагмента Яг при смешивании с АТР, взятой в рааличных концентрациях; смешивание проводилось в устройстве, применяемом в методе остановленной струи 1051. 1,8.10а М-'с-'. Это на два порядка ниже константы скорости лимитируемой диффузией реакции и указывает на то, что, возможно, связывание происходит в две стадии. Измерения при 242 ГЛАВА т более высоких концентрациях подтверждают это предположение (рис.
7.10), Показано, что имеется начальная, быстрая стадия, находящаяся за пределами разрешения метода остановленной струи, сопровождающаяся изомериэацией со скоростью 400 с-'. Константы йэ и й4/й 4 можно определить из концентрационной зависимости констант скорости так, как описано вгл.4. Аналогичные данные были получены и при исследовании связывания А!УР. При низких концентрациях константа скорости второго порядка для связывания АРР равна 1,5 10' М-'с-', а при высоких скорость выходит на плато и становится равной 400с-', что свидетельствует о наличии стадии изомеризации, характеризующейся константой й,.
Константа й, слишком мала, чтобы ее можно было прямо измерить. В опытах по катализируемому фрагментом Б, синтезу [мР]АТР и [мР]ортофосфата для нее были получены значения 3 !0-4 с ' и 2 10 г с-' [66, 67]. 4. Равновесие между М*.АТР и М**.А].4Р.Р Эта стадия исследовалась с помощью смешивания избытка фермента с [у"Р]АТР и измерения концентраций [у"Р]АТР и ['АР]ортофосфата методом остановленной струи [63]. Равновесие на поверхности фермента быстро устанавливается и медлен.
но нарушается по мере того, как М**.АВР.[э'Р]Р иэомеризуется с образованием М'.АОР["Р]Р со скоростью 0,06 с-'. 5. Измерение светорассеяния При полимеризации актина (мол. Вес 42 000) образуются крупные агрегаты. Каждый мономер может связать один моль фрагмента 64 (мол. Вес 115000), и образующийся в результате актомиозиновый комплекс (акто-Ь,) имеет приблизительно в три раза большую массу. Этот процесс сопровождается увеличением мутности раствора, поскольку светорассеяние свяэанос массой полимера. Стимулируемое АТР высвобождение 64 из комплекса можно исследовать, наблюдая за умсньшением мутности раствора. Для этого прменяют метод остановленной струи с регистрацией оптической плотности.
Более чувствительным, однако, является метод регистрации флуоресценции, поскольку в этом случае измерения проводятся под прямым углом к падающему световому пучку (гл. 6) [69]. кинвтнчаскнв методы и механизм данствня оврмвнтов 243 Е. Фосфофруктокиназа: определение аномерной специфичности методом остановленной струи, замороженной струи и с помо4цью использования субстратов с фиксированной конфигурацией Фосфофруктокиназа катализирует фосфорилирование фруктово-6-фосфата до фруктово-1,6-дифосата. В растворе субстрат существует в виде смеси двух аномеров — а(20%) и Р(80%), переходящих один в другой через образование открытой кето- формы. П-фруктово-6-фосфат+ АТР— ь Э-фруктово.1,6-дкфосфат+ АПР. (7.21) з-ороси сн.он ,он Т-О'А) р-яиавер(-$0ад~ ОаРО н,он (7.22) н он 77 (-20У,) Применение методов исследования быстрых реакций, позволяющих измерить скорость взаимопревращений аномеров, показало, что фермент специфичен к р-аномеру.
К такому же выводу привело и определение активности фермента по отношению к активности модельных субстратов, фиксированных в одной из этих конфигураций. При использовании достаточных количеств фермента, позволяющих фосфорилировать весь активный аномер прежде, чем между а- и р-формами установится новое равновесие, выявилось, что 80% данного субстрата реагирует быстро, а остальные 20% — с константой скорости аномеризации этого субстрата. Кинетика процесса исследовалась методом замороженной струи с применением [уззР]АТР (70) и с помощ ю спектрофотометрического анализа реакции (7.19) 171).
Использовались также данные стационарной кинетики с примененном глава т следующих субстратов 172]: '-О,РОСН, м о НО ( — ОН, — СН«ОН) У„«« = 100%, он Км=о«04ЗН«)т о.н- -фруктово-З-фосфат У "87%, Км=ог41ММ «ОБ ОН 2,5-ангийро-и-ма ни итал-Ьфосфат (фиксированный в р-конфигураиии) '-О,РОСН СН,ОН У„= 0%, К 0,34 хгйl (Коннов внт нога иигйоитвр) 2,5-ангиоро-В-глфцитол-Ьфвсфат (фиксированный в и-конфигурации) Ж.
Аффиниые метки [73] Аффинная метка или, иначе говоря, необратимый ингибитор активного центра, представляет собой химически активное соединение, близкое по своей структуре к субстрату. Это соединение специфически связывается с активным центром фермента и 2,б-ангидро-Р-маннитол-!-фосфат может находиться только в одной фиксированной конфигурации, аналогичной конфигурации р-аномера 1)-фруктозы. В этом соединении в положении 2 отсутствует ОН-группа и оно не способно принять конфигурацию, аналогичную конфигурации а-аномера, поскольку кольцо не можетраскрыться.
С другойстороны, производное глюцитола всегда имеет конфигурацию, аналогичную конфигурации а-аномера. Из анализа значений У,„и Км (или Кг) видно, что, хотя с ферментом связываются оба соединения, только р-аномер связывается продуктивно и фосфорилируется. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 945 образует ковалентные связи с аминокислотными остатками белка [74 — 76].
Аффинные метки очень полезны для идентификации аминокислотных остатков, участвующих в катализе, и при определении рК, из РН-зависимости скорости модификации. к, гг Е+1 й==и Е.! — о Š— 1. (7.23) Реакция аффинной метки с ферментом начинается с образования обратимо связанного комплекса фремент — ингибитор, далее следует стадия ковалентной модификации фермента и, следовательно, необратимое ингибирование, Эта схема аналогична механизму Михаэлиса — Ментен, а потому при возрастании концентрации ингибитора должно наблюдаться насыщение. Решение кинетического уравнения для этого случая приведено в гл. 4 ]уравнение (4.71)].
Для простого случая неравновесного связывания, за которым следует медленная стадия химического превращения, справедливо уравнение 74 [Е! [1] — 41Е]/Щ= К +[1]. (7.24) Таблица 7.11 Высекав реакцноинак способность аффинных модификаторов а) Коистаита скорости аторого иоряака, --4 -4 М с Реакция Сьх-ь-февилаланинхлорметилкетаи + химотрипсин [влкилирование Н)а-57) Сьх-Ь-фенилаланинхлорметилкетон + ацетилти- стидин 69 4,5 ° 10 а) ЗЬа а Е. Н., Ноас)са Я., АгсЬа В)осЬеас В)орЬуа..
14$, 484 (1971). Принцип данного метода очень хорошо иллюстрируется одним из первых экспериментов по применению аффинных меток — исследованием реакции тозил-[.-фенилаланинхлорметилкетона (ТРСК) с химотрипсином ]74]. ТРСК сходен с такими Поскольку связывание «субстрата» с ферментом является специфичным, скорость химической реакции, протекающей в пределах фермент-«субстратного» комплекса, чаше всего достаточно высока благодаря энтропийному преимуществу ее над простой бимолекулярной реакцией в растворе. Следовательно, соединения, которые обычно обладают низкой реакционной способностью, могут стать очень реакционноспособными аффинными метками. глав ~ субстратами, как метиловый эфир тозил-н-фенилаланина, но содержит хлорметилкетонную группу, являющуюся алкнлируюшим агентом.
Известно, что галоидметилкетоны реагируют с тиолами и имндазолами. Процесс необратимого ннгибирования химотрипсина ТРСК имеет следующие особенности 173, 74]: сн,сн оМв НН с ~' сн сн сн — с1 )чн трск СЦз а. Скорость инактивации фермента подавляется обратимыми ингибиторами или субстратами фермента. б. График зависимости относительной скорости ингибирования от рН при низких концентрациях ингибитора ((!] (( К1) имеет внд колоколообразной кривой с такими же значениями рК„какие были найдены из рН-зависимости й, ~/Км в случае гидролиза субстратов.
в. С помощью ингибитора, меченного радиоактивным углеродом, показано, что инактивированный фермент связывает один моль ингибитора на один моль активных центров. г. Согласно более поздним данным, кривая зависимости скорости инактивации от концентрации ингибитора выходит на плато при достаточно высоких концентрациях последнего («Кмэт0,3 мМ) (77]. (Проведенные позже исследования показали, что модифицируемой аминокислотой в активном центре является Н!з-57) . Все эти свойства в совокупности являются тестом на выявиие аффииной метки, модифицирующей в активном центре группу, ионизация которой контролирует активность фермента.
Наличие кинетики с насыщением (п. г) показывает, что метка образует комплекс с ферментом, хотя это можно и не обнаружить, если К, лежит в области концентраций, при которых ингибитор не растворяется. Конкурентное ингибирование субстратом (п. а) подтверждает, что связывание происходит в активном центре.
Стехиометрическое соотношение 1: 1 означает, что эта модифинация является избирательной. Ценные данные позволяет получить анализ рН-зависимости различных параметров. Как отме- кннатичаскив матоды и махлнизм двиствня фвомаитов 247 чалось в гл. 5, рН-зависимость У . /Км или йьм/Км дает РКа тех групп в свободном ферменте, которые участвуют в катализе н связывании субстрата. Аналогичным образом из рН-зависимости параметра й~/К, (илн относительной скорости реакции при Я ((Кь поскольку в этих условиях скорость пропорциональна й~/К~), мы получаем рК, тех групп в свободном ферменте, которые участвуют в связывании и вреакциисингибитором. Следовательно, рН-зависимости й..~/Км и /г~/К~ должны дать идентичные наборы значений рК„если аффинной меткой модифицируются те же группы, что и участвующие в катализе.
Аналогично тому как из рН-зависимости й„~ мы получаем рК, фермент-субстратного комплекса, рН-зависимость й, дает значения рК, комплекса фермент — ингибитор (с оговорками, указанными в гл. 5). Ферменты всегда таят в себе много неожиданного для энзимолога. Так, например (см. гл. 12, равд. Е.2), аффинная метка 1,2-ангидро-О-маннитол-б-фосфат присоединяется к остатку глутаминовой кислоты в глюкозо-6-фосфатизомеразе (78), СНО ОН НО НО ОН ОН ОН Н СН,ОРО, Ь,2-ангара и-манн этол-6- фоо(оагп СНгОРОз Гл гоного-6- 1бо офлаг Установлено, что в этом случае имеет место кинетика снасыщением, субстраты препятствуют модификации, стехиометрия инактивации равна 1: 1, а рН-зависимость й1даетзначения рК, для комплексов фермента с ингибитором, близкие к рК, фермент-субстратиого комплекса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
