Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Например, если а, [нао~ кз — — НСОаН Е+ НСООД' ч=~ Е.КСООЯ' — ] Аа1к1 — нсо-м, (7.7) то для исчезновения эфира Асад~м = (Аа [Нао] + Аз (А 1)/Д з. (7.8) 3. Выявление ацилфермента при гидролизе амидов и пептидов 1141 При гидролизе амидов ацилфермент не накапливается и обнаружить его довольно трудно. К счастью, для этого можно воспользоваться методикой прямого обнаружения промежуточного соединения, применявшейся в случае эфирных субстратов.
Образование ацилфермента при гидролизе производных ацетил-).-фенилаланина (АсР)ае) было установлено исходя из следующих данных: а. При гидролизе амидов в присутствии акцепторов-нуклеофилов получается такое же соотношение между продуктами, как и при гидролизе метилового эфира ацетил-(.-фенилаланина (АсРпеОМе) в аналогичных условиях (табл.
7.4). Более того, соотношение между продуктами оказалось таким же, какое ожидалось исходя иэ прямого спектрофотометрического исследования атаки нуклеофилами АсРпе-химотрипсина, генерированного!и з11ц методом остановленной струи (табл, 7.5). б. В условиях, когда более 94% реагирующего амида образует АсРпе-нуклеофил, скорость исчезновения амида практиче- [Ситуация, естественно, усложняется, если нуклеофилы связываются с ферментом и оба (и нуклеофил, и субстрат) конкурируют за один центр.] Увеличение скорости деацилирования при добавлении нуклеофилов использовалось для получения константы скорости деацилирования (й,) в случае тех субстратов, для которых стадия с константой йа обычно является лимитирующей. 1,4-бутандиол — достаточно хороший нуклеофил, чтобы его присутствие даже в умеренной концентрации приводило к увеличению скорости деацилирования до значения, большего чем й, [27].
Значения некоторых констант скорости, полученных этим методом, приведены в табл. 7.3. Итак, очевидно, что исследование соотношения между продуктами является мощным методом обнаружения промежуточных соединений. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ Таблица 7.4 Соотпошеиие между продуктами, образующимися и ходе каталпаируемого Ь-химотрипсином гпдролпза субстратоп при рН = 9,3 и 25 "С [14] Трзяседялироееяиея'ядроляз, М Акпептор А!амНз О!уННз Нзнннз Субстрат Аср(зе-ОМе АсР(зе — 1ЧН вЂ” ~~ у, — !ч+Мез 1,8 Аср(те-А1 аННз Таблица 75 Коистаитй скорости для атаки Асрие-Ь-химотрппсииа иуклеоцзплами при РН 9,3 п 25 'С [14[ а, М-'с-' Нуилсофил рассчитало из даяимх по соотяошеиию между продуктами е! прямые кяиетичесияе изиереияя 4,8 ° 10з 1,5 ° 1Оз З,З ° 10' 142 с-') 62.
!оз 1,6 ° ИР 2,8. 10' А! аННз а!ТНН, (НзО е! Иэ даяямх табл. 1,4. ски не возрастает. Это согласуется с тем, что атака нуклеофила происходит после лимитирующей стадии, т, е. после образования промежуточного соединения, и что по крайней мере на 94% реакция идет через образование этого промежуточного соедине- НИЯ. в, Последний довод в пользу образования в ходе реакции ацилфермента дает расчет константы скорости реакции гидро- лиза из константы скорости обратной реакции (синтез субстрата через образование ацилфермента) и уравнения Холдедма (гл. 3, равд.
3). Установлено, что амины реагируют с ацилферментом с образованием амидов и пептидов. Следовательно, согласно принципу детального равновесия, должна иметь место обратная реакция (гидролиз пептидов с образованием ацилфермента). глава г Вопрос состоит в том, достаточно ли высока скорость этой реакции, чтобы объяснить наблюдаемуюскоростьгидролиза. На этот вопрос можно ответить, измерив (йьм/Км)з для реакции синтеза пептида через стадию образования ацилфермента, определив К ч для гидролиза этого пептида и затем рассчитав (й.и/Км)н для реакции гидролиза из уравнения Холдейна (К,„ = = (дала[/Км) н/ (йсм/Км) з) . Рассчитанное значение близко к по. лученному экспериментально.
4. Обоснованность выводов, полученных при исследовании распределения продуктов, и возможные источники ошибок Ни постоянство величины У „, ни постоянство соотношения между образующимися продуктами еще не доказывают присутствия промежуточного соединения. Например, оказалось, что в случае щелочной фосфатазы постоянство значения г' „является артефактом, а кроме того, нельзя сказать а рг!ог1, что атака комплекса Михаэлнса акцепторами также не даст постоянного соотношения между образующимися продуктами. Для того чтобы из указанных экспериментов можно было сделать четкий вывод о наличии промежуточного соединения, их необходимо связать с измерением скоростей.
При измерении скоростей в рамках стационарной кинетики наиболее благоприятной являет. ся такая ситуация, когда промежуточное соединение накапливается. Если выполняются уравнения (7.4) — (7.6), можно сделать четкий вывод о существовании промежуточного соединения. Чрезвычайно полезно сочетание опытов по установлению распределения продуктов с исследованиями предстационарной кинетики (как это было сделано в случае химотрипсина и амидов). Возможным источником ошибок является нежелательное изменение свойств ферментов.
Химотрипсин часто рассматривают как раствор имидазола и серина. Однако белки крайне чувствительны к окружению; они могут неспецифически связывать органические молекулы н ионы, изменяя прн этом свои кннетиче. ские свойства. Первое правило, которого следует придерживаться при постановке экспериментов, состоитвтом,что реакции необходимо проводить при строго фиксированных, одинаковых концентрациях фермента. Многие белки склонны к агрегации, что может привести к изменению констант скорости.
Второе правило гласит: соотношение между продуктами следует определять путем непосредственного анализа продуктов, а не из косвенных данных. Например, скорость атаки ацилфермента бензоил-Туг-химотрипсина глицинамидом (О!у(чН,) была в свое КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ хФ7 время определена из данных по уменьшению ч.м для гидролиза бензоил-Туг-О!у[ХН, при добавлении 61у!ХНК (61уМН~ ингибирует эту реакцию, поскольку реагирует с ацилфермеитом с образованием бензоил-Туг-б!у1ХН,.) Как оказалось, присоединение аминов к химотрипсину приводит к увеличению Й„1 на 30'тз [14].
Это увеличение имеет тот же порядок величины, что и ожидаемое уменьшение, обусловленное обращением реакции. Вообще говоря, если изменения скорости ферментативных реакций невелики, эти данные нельзя считать надежными, поскольку изменения могут быть обусловлены причинами кинетической природы. В ряде ситуаций простые правила распределения промежуточных соединений перестают выполняться. Если акцептор-нуклеофил реагирует с ацилферментом до того, как успевает произойти диффузия уходящей группы от фермент-содержащего промежуточного соединения, то распределение может зависеть от природы уходящей группы (т.
е. обусловливаться стерическим затруднением атаки и т. д.). Кроме того, измерение констант скорости атаки нуклеофилами промежуточного соединения может привести к не совсем верным результатам вследствие упоминавшихся выше эффектов неспецифического связывания. В. Другие примеры обнаружения промежуточных соединений с помощью исследования распределения продуктов и из кинетических данных 1. Щелочная фосфатаза Почти нет сомнения в том, что при гидролизе этим ферментом эфиров фосфорной кислоты образуется фосфорилфермент. Фосфорилфермент стабилен при низком рН и его можно выделить [28, 29]. Исследование распределения продуктов с использованием трис-буфера в качестве акцептора фосфата показало, что соотношение между продуктами постоянно (табл 7.6) [30, 31]. Результаты проведенных ранее кинетических исследований должны оцениваться в свете последних данных, согласно которым выделенный фермент может содержать прочно, хотя и нековалентно связанный фосфат [32], а лимитирующей стадией реакции при высоком рН является высвобождение этого прочно связанного фосфата 122„23] (правда, единого мнения относительно кинетики или стехиометрии связывания нет) [33,34].
Как отмечалось выше, постоянство У ,„ в реакциях гидролиза широкого круга эфиров фосфорной кислоты (табл. 7.7) [19, 20] ГЛАВА 7 Таблица 7,б Относительные значении У дли катализируемого щелочной фосфатазой гвдролнза зфнроз фосфорной кислоты [20) бСТР Рвбозо-5-фосфат 8-Глицерофосфат Этаиоламинфосфат Глюкоза-1-фосфат Глюкоза-6-фосфат Гнстндннфосфат л-Нитрофеиилфосфат обусловлено, вероятно, тем, чтолимитирующей стадией являетса медленная диссоциация комплекса фермент — продукт. НОСН2 СНз — ОРО«е НОСН« — С вЂ” НН« НОСН« — С вЂ” 'НН« НОСН, НОСНз Трнс [трис-(оксиме- О-фосфорнл-трио твл)-амииометав[ Таблица 7.7 Соотиошеиве между продуктамв длн каталвзвруемого щелочной фосфатазой гндролвза зфвров фосфорной нислоты в фосфоамвдатов [30, 31) трвнсфосфорнлвро ее«не)Г«кров«« в) Фосфвт Фенил Крезвл Хлорфеинл л-трет-Геутгш феи ил л-Нитрофеиил о-Метакса-л-метилфеиил а-Нафтнл [1-Нафтнл л-Нвтрофенвл Фосфоамидаты е) Акцептор ) М трнс) ри В.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
