Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Другой метод исследования фосфофруктокиназы основан на превращении фруктозодифосфата в диоксиацетонфосфат и глицеральдегид-3-фосфат с участием альдолазы, изомеризации триозофосфатов с помощью триозофосфатизомеразы и последующем измерении количества образовавшегося )ЧАРН в ходе реакции окисления глицеральдегидфосфата глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеназой. 5. Автоматическое титрование кислоты или основания Гндролнтнческую реакцию, в ходе которой происходит высвобождение кислоты, удобно исследовать с помощью титрова. ния основанием. Лучше всего использовать для этого автоматическое титрование с применением рН-стата, когда рН раствора, регистрируемый стеклянным электродом, поддерживается постоянным благодаря добавлению основания с помощью шприца, управляемого электронным устройством.
Объем, в котором протекает реакция, составляет всего 1 мл, а минимальное количество основания, которое можно зарегистрировать, равно 50 нмоль (5 — 10 мкл раствора основания с концентрацией 5 1О-' — 1 1О-з М). Обычно источником ошибок здесь является изменение рН раствора под действием растворенного СОВ 6. Применение радиоактивных изотопов Наиболее чувствительные методы анализа основаны на использовании радиоактивных субстратов. Объем реакционной смеси составляет в этом случае всего 20 — 100 мкл.
Радиоактивность измеряется в кюри (Кн); ! Ки = 2,22 10" расп мин-'. На практике ее характеризуют числом импульсов в 1 мин. Для измерения радиоактивности используют сцинтилляционные счетчики, способные регистрировать излучение, испускаемое радиоактивными изотопами 'Н, '4С, 448 и "Р. ПРАКТИЧЕСКАЯ КИИЕТИКА 197 Эти изотопы при распаде испускают р-частицы (электроны), которые вызывают свечение сцинтиллятора, регистрируемое фотоумножителем (см, приложение).
Эффективность счета при низкоэнергетическом излучении, испускаемом изотопом 'Н, составляет 1б — 40оур, а для изотопов '4С, абБ и 'УР эта величина достигает 80')о, Благодаря тому что энергетический спектр излучения аН существенно отличается от спектров излучения других изотопов, распад 'Н можно регистрировать в их присутствии, проводя измерение радиоактивности в разных областях энергетического спектра (опыты с двойной меткой) (табл. 6.1.). Таблица бд Некоторые часто использующиеся радиоактивные изотопы Удельная активность при !артс-ном аба. гаженин, Кн моль Максимааьаая анергиа иааученнк, Мвв Период полураспада Иаагап Тип иалучеиня "С аН аа5 аар ма[ 1а!1 р-частицы й-частицы й-частицы 6-частицы -лучи -частицы и у-лучи у-лучи 5730 лет 12,35 лет 87,4 сут 14,3 сут 60 сут 8,06 сут 0,156 0,0186 0,167 1,709 62,4 2,9 ° 10' 1,49 1Ое 9,13 ° 1Ое 2,! 8 ° 1О' 1,62 ° 1О' 0,247 — 0,806 газе 1,09 10' 120 сут Таблица 6.2 Некоторые меченные радноактнвнымн нзотопамн субстраты, имеющиеся в Радиохимическом центре (Ащегзпащ) Удельная активность, Ки моль Чувсгвктель.
ность, пмольа! Субстрат ["С[ Метионин (обогащеиие 907о) [Ме'Н) Метионии [ааз[ Метионин [тааР) АТР 8 ° 101 3 ° 1Оа 15 10е 0,1 0,0! 1 ° 10 4 2 ° !О М Определяется исходи на того, что минимальное число импульсов в минуту, которое можно аарегнсгрнроаагь, равно бо. Излучение изотопа акР характеризуется настолько высокой энергией, что его можно регистрировать без сцинтиллятора, используя эффект Черенкова. При прохождении через воду или полиэтиленовую ампулу электроны движутся так быстро, что ТЛАВА б спонтанно испускаюз фотоны, которые удается регистрировать с эффективностью порядка 40ей с помощью счетчика с открытым окном.
Этот э~фект был использован для подсчета числа распадов изотопов 'Р и '"С, одновременно присутствующих вобразце, сначала с помощью излучения Черенкова, а затем повторным подсчетом в присутствии сцинтиллятора. Чувствительность методов с использованием радиоактивных изотопов зависит от удельной активности препарата (табл. 6,2). Иногда удается обнаружить соединение, когда его количество не превышает !О-" моль, что на 6 — 7 порядков меньше, чем минимальное количество, которое можно зарегистрировать спектрофотометрически. Возможные источники ошибок а.
Тушение. Излучение трития настолько слабое, что практически целиком поглощается фильтровальной бумагой, хроматографической пластинкой, на которой адсорбирован образец, или осадком. Излучение изотопа '4С регистрировать легче, но иногда максимум энергетического спектра смещается в сторону меньших энергий. Следует иметь в виду, что окрашенные соединения или древесный уголь могут поглощать свет, испускаемый сцинтиллятором. б. Перенос 'Н, В ряде случаев тритий переносится с субстрата на растворитель или белок. В связи с этим, а также имея в виду сказанное выше, лучше использовать другой изотоп— "С, хотя более высокая удельная активность и относительно небольшая стоимость соединений, меченных тритием, часто компенсируют указанные недостатки.
в. Другие источники ошибок. Вода уменьшает эффективность счета, поэтому она должна присутствовать в образцах в строго фиксированном количестве. Иногда к артефактам приводит добавление основания. Необходимо также иметь в виду, что освещение сцинтилляторов вызывает их фосфоресценцию, которая может длиться несколько минут. Разделение продуктов реакции Совершенно очевидно, что для исследования той или иной реакции необходимо отделить продукты от исходных реагентов, а затем измерить радиоактивность. Весьма удобными методами разделения являются хроматография и высоковольтный электрофорез, поскольку бумаг» можно разрезать на полоски и точно измерить их относительную радиоактивность. Еще удобнее использовать для избирзтельной адсорбпии или выделения нужного соединения прокладку из фильтра Например. меченую АТР прхктичвскАя кинвтикА можно адсорбировать на древесном угле, который затем собирается на стеклянном фильтре, или на диске, содержащем древесный уголь.
Для избирательной адсорбции анионов используются фильтры из диэтиламмонийметилцеллюлозы, а катионов— фильтры из карбоксиметилцеллюлозы. Белки и любые прочно связанные с ними лиганды часто адсорбируют на фильтрах из нитроцеллюлозы. Ковалентно меченные белки или полинуклеотиды можно осадить кислотой и собрать на стеклянном фильтре (если образуется плотный осадок) или на нитроцеллюлозе (если осадок рыхлый). Эти фильтры не уменьшают эффективности регистрации излучения "С и хеР. Б. Графическое представление кинетических данных 1.
Экспоненты а. Простая экспонента Для реакции первого порядка А — ~ В (6.5) концентрация вещества В в момент времени [, [В) ь связана с конечной концентрацией !В] соотношением [В[, [В) [! — ехр ( — ы)], (6. 6) или [а ([В[„— [в[,) - [и [В[„— Ы (6.7) [сравните с уравнением (4.5)). Обычно й находят из графика, построенного в координатах [[; 1п( [В] — [В]е)]. Использование этой анаморфозы требует предварительного определения предельной концентрации [В); следует отметить, что небольшие отклонения в оценке этой величины не будут приводить к существенным искажениям параметров, которые определяются из прямой, проведенной с помощью метода наименьших квадратов.
б. Метод Гуггенгейма В тех случаях, когда не удается найти предельное значение !В], можно воспользоваться методом Гуггенгейма [2), исполь* зуя зависимость !и ([В[с+А, — [В1е) сопе[ — Ак (6.8) Константа й определяется из графика, построенного в координатах [й [п([В]шее — [В)с)], где Ж вЂ” постоянный отрезок времени, составляющий по крайней мере два-три периода полу.
превращения. 2ОО ГЛАВА В в. Разность акспонент Найти константы скорости для процесса, описываемого уравнением [В) = Х (ехр ( — й,!) — ехр ( — йз1Ц (8.9) [сравните с уравнением (4.29)), относительно просто, если одна из констант скорости в 5 — 10 раз больше другой. Используя О аа И+ аб йВ 1() Время,с Рис.
6,2. Графический метод аиализа кинетики реакции, подчиняющейся уравиеиию (6.9). График построен в коордииатах О; )п[В)). Коистаита скорости медлеяиого процесса определяется из наклона лииейиого участка кривой, когда быстрый процесс уже завершился. Константа скорости быстрого процесса определяется из графика зависимости !и а (разиость между значением коицеитрации В в данный момент времеви и значением, получеииым зкстраполяцией линейного участка, как показано иа рисунке) от времени, построенного по начальным точкам кривой. Для рассматриваемого примера константы скорости равны 20 и 2 с-'.
точки кривой, соответствующие временам г, в 5 — 10 раз превышающим время полупревращения для первого процесса, строят по ним в полулогарифмическом масштабе прямую, которая относится только ко второму процессу, поскольку первый уже завершился. Затем подставляют полученные данные вуравнение (6,9) и находят константу скорости более быстрого процесса. Часто эта процедура выполняется графически, как показано на рис. 6.2. Если константы скорости разделить таким способом не пкхктическля кннитнкл гв) удается, проще попытаться изменить их соотношение, изменив условия проведения реакции, чем прибегать к методу наименьших квадратов. 2. Реакции второго порядка ьз л+ в — с.
(6.10) Кинетику реакций второго порядка удобнее всего анализировать, если «превратить» их в реакции псевдопервого порядка, приняв, что концентрация одного из реагентов намного выше концентрации другого. При [А) » [В! концентрация А за время реакции практически не изменяется и, следовательно, 4 [суш = — 4 [в]дн = а, [л], [в]. (6.11) Исчезновение В и накопление С представляет собой реакцию первого порядка с константой скорости псевдопервого порядка й, [А) м Построение графиков для серии таких реакций, имеющих разные значения [А)о, позволяет определить йь Когда начальные концентрации веществ А и В близки, аналитическое решение кинетического уравнения имеет вид (1и [л]о [В]/[В]о [л])/([в]о — [л]о) ан, (6.12) которое трудно представить в графической форме.
Однако ситуация существенно упрощается, если [А[о =[В)о. В этом случае аналитическое решение имеет вид (/([л]о — [с1) — ! дл]о = ан. Это простое уравнение достаточно точно выполняется, даже когда начальные концентрации не совсем равны друг другу. В этом случае вместо [А)а в уравнении (6.13) следует использовать среднее между значениями [А), и [В) м 3. Кинетики Михаэлиса — Ментен Несмотря на то что в последнее время для приведения экспериментальных данных к виду, соответствующему интегральной форме уравнения Михаэлиса — Ментен, очень широко применяется ЭВМ и это даже стало чем-то вроде моды, лучше всего для определения Й~.ь Йс.~/Км и Км ис~ользовать классический подход, заключающийся в измерении начальных скоростей (т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
