Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 28
Текст из файла (страница 28)
При высоких РН й, й „а по мере его понижения ы1-злвисимость ско1 ости Ферментлтивных 1 елкции 175 л, уменьшается вследствие протонирования основания, пока не станет меньше л ь Это приводит к тому, что кажущееся значение рК„ определяемое из рН-зависимости Йрм1Км, получается меньше рК. участвующего в катализе основания (рис. 5.3) (71.
Можно показать, что кажущаяся константа ионизации определяется соотношением Карр = Кв (Лр+ й-П/й-ь ! (5.3!) где К,— константа ионизации данной группы фермента. К,рр называется кинетическим рК„поскольку он определяется не ионизацией как таковой, а зависит от отношения констант скорости процессов, не связанных с переносом протона. Кинетические рК. получаются всякий раз, когда природа лимитирующей стадии изменяется с изменением рН. 3. Экспериментальное определение кинетических и равновесных рК, (7, 8) 4.
Микроскопические и макроскопические рК, Когда кислота представлена различными формами, например НЕБ и НЕ5' [схема (5.26)), рК. каждой из этих форм называется микроскопическим рК, системы, определяемый титрованием, например рК,ь, в уравнении (5.29), называется по- рК„которые представляют собой комбинацию констант равновесия и рК, конкретных титрующихся групп (как в случае непродуктивного связывания; уравнение (5.29) ), определяются в ходе титрования как реально существующие рК.. Если в фермент-субстратный комплекс (схема (5.26) ) включить кислоту или основание, то каталитическая группа будет титроваться в соответствии с рК„определяемым уравнением (5.29). Аналогичным образом, если измерять с помощью того или иного спектрального метода долю основания, находящегося в ионизированной форме, то обнаружится, что оно ионизируется с рК„ определяемым уравнением (5.29).
Иначе обстоит дело с кинетическими рК.. Для механизма Бриггса — Холдейна, характеризующегося тем, что природа лимитирующей стадии изменяется с изменением рН, прямое титрование каталитических групп будет давать истинную константу, отличающуюся от соответствующих величин, получаемых нз рН-зависимости и„~/Км (см. уравнение (5.3!)1. 176 ГЛАВА 5 азному: макроскопический, каскущийсл или групповой рК,. отличие от кинетического этот рК.
во всех случаях является истинным, Г. Влияние поверхностного Заряда на рК, групп в ферментах На поверхности молекулы фермента находится множество полярных групп. Так, например, на поверхности химотрипсина локализованы 4 остатка аргинина и 14 остатков лизина, которые имеют положительные заряды, и 7 остатков аспартата и 5— глутамата, заряженных отрицательно. Это приводит к созданию вокруг молекулы фермента ионного окружения, т.
е. электростатического поля, которое может стабилизировать или дестабилизировать находящиеся внутри белковой глобулы (или ча. стично погруженные в нее) ионные группы. Проведенные Линдерстрем-Лангом расчеты показали, что изменение рК, погруженных групп является сложной функцией размера и формы молекулы белка, а также ионной силы раствора [9]. Значение этих эффектов четко показано в ряде работ, в которых расположенные на поверхности карбоксилат- или аммоний-ионы подвергались химической модификации.
При высоком рН активный центр химотрипсина несет отрицательный заряд, а при низком — нулевой. Можно ожидать,что оснбвная форма активного центра при высоком рН будет стабилизироваться положительным поверхностным зарядом и дестабилизироваться — отрицательным. Как видно из табл. 5.2, это предположение подтверждается экспериментально. Превращение 14 положительно заряженных остатков лизина в отрицательно заряженные карбоксилат-ионы при взаимодействии химотрипсина с янтарным ангидридом приводит к тому, что рК, группы, степень ионизации которой определяет рН-зависимость й,.~ для гидролиза метилового эфира ацетилтриптофана, увеличивается от 7,0 до 8,0.
И наоборот, превращение 13 отрица. тельно заряженных карбоксильных групп в положительно заряженные амины понижает рК, до 6,1. Аналогичным образом ацилирование поверхностных аминогрупп трипсина уксусным ангидридом приводит к увеличению рК, свободного фермента на 0,2 единицы. Эти эффекты можно промоделировать с помощью изменения рН.
При рН (5 карбоксильные группы протонируются, а при рН ) 9 аммонийные группы лизина в результате депротонирования начинают утрачивать свой положительный заряд. При экстремальных значениях рН это вызывает изменение кривых титрования фермента. Наиболее сильно такие эффекты проявля. рИ.ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ Таблица Б.р Влияние певерхнестиеге заряда фермента яа рКа 1 Аса1 рка -Фермент Молнфнкнцпн 7,06) 8,06) тр а) Сукцннилхимотрипсиил) 47 (76(НН) 74 -о — ННОССНзСНзСО Азр, О)п( — СО ) -о о — СОНН (СНз)зыН' Этиленднаминхимотрип. сии Трипсинп) Ацстилтрнпсинп) 7,0г) 0,7 1,2 7дг) (.76 (НН ) -о — ННСОСНа ются при низкой ионной силе — 0,2 М или меньше; при повышении концентрации солей эффекты уменьшаются, а в1Мрастворе исчезают совсем. К счастью, многие кривые титрования полу.
чены при рН между 5 и 9, когда титруется небольшая часть поверхностных групп; хорошие результаты получены при ионной силе 0,1 М 18,10). На константы скорости стадий, в ходе которых совершаются химические превращения, влияет не только изменение рК, участвующих в катализе кислот или оснований, но и изменение поверхностного заряда, если оно достаточно велико. Это изменение аналогично изменению ионной силы в неферментативных ионных реакциях, а два указанных эффекта аналогичны вторичному и первичному ионным эффектам в физической органиче. ской химии.
Д. Графическое представление данных Предположим, что один из таких кинетических параметров, как й.,(, определяется долей фермента, находящегося в форме кислоты. В этом случае скорость реакции будет зависеть от константы ионизация К, и рН следующим образом: (»)са() рса( 1Н 1ф~а + ~Н 1)» (5.82] М Ь-кнмотрнпснн, М 'С. копана сила 9,1. Ча!слане!а Р., ВепЬег М. ), В!осЫт. Ыориуз. Ас1а, 366, 696 (!971).
6) РК„ОПР аЮЩпп ага( ДЛН Рсапппа ГНДРОаааа МЩПЛОаОГО Зфкпа ажтпапптРНП. тофана. е) Зротег тг. е., н»ооиоп Х Р., В!осЫщ. Ыориуз. Ас1а, 933, !64 (19У(). Г) РК, ОПРЕДЕЛаЮЩна Аеа(/КМ' ЛЛН РЕаКЦИИ ГНЛРОЛпаа аМИДа зопаеаааеаРГННННа. а' ГЛАВА 3 178 где (Й„г)н — наблюдаемая величина при данной концентрации Н+ [уравнение (5.8)]. Уравнение (5.32) по форме идентично уравнению Михаэлиса — Ментен, и, следовательно, К, можно го гпп Ъ )5Р гоо гпп гоп гпп оао (к.п(]км) ~Н 7хта',с-' Рис. 5.4.
Пример применения уравнения (5.84) для определенна рКь активного центра фермента. Здесь вместо А,м/Км используется я,м (гидролиз аце- тил-|.тирозин-л-ацетиланилида м.химотрипснном при 25 нС (8)), найти, построив графики, аналогичные графикам Лайнуивера— Бэрка и Эди [уравнения (3.28) и (3.29)]. Например, (5.33) и, следовательно, йсм и К. определяются из графиков, построенных в координатах ((йсм)н/[Н+]' (йсаг)н).
Аналогично, если скорость зависит от содержания оснбвной формы фермента, то рн-злвисил1ость скоростн еерментлтивных релкцнп !79 можно показать, что (5.34) Б этом случае строят график в координатах ((й ~)н[Н+1; (йса~) н) ° В более сложных случаях, когда кинетический параметр не уменьшается до нуля прн высоком нлн низком рН (как это часто имеет место на графиках зависимости констант ассоциации нлн дцссоцнацнн от рН), для графического анализа используется разность между наблюдаемым значением параметра прн данном рН н одним нз предельных значений прн экстремальных рн.
Е. Примеры и экспериментальные данные Ферментом, кинетические свойства которого прн разных рН изучены лучше, чем свойства остальных ферментов, является хпмотрнпснн; хорошо известны его структурные особенности н механизм каталитического действия. Чрезвычайно широкая спецнфнчность хнмотрнпснна н, следовательно, возможность непользования различных субстратов позволяет исследовать простой механизм Мнхаэлнса — Ментен, механизм с накоплением промежуточных соединений, обнаруживать непродуктивное связыванне н анализировать механизм Брнггса — Холдена с измененнем природы лимитирующей стадии прн варьировании рН.
рН-завнснмость А,.~/Км для гндролнза субстратов имеет внд колоколообразной кривой с максимумом прн рй 7,8 н рК„ равными 6,8 н 8,8, для а-хнмотрнпснна н максимумом прн рН 7,9 н рК., равными 6,8 н 9,1, для 6-хнмотрнпснна. Значение рК, = 6,8 соответствует ноннзацнн каталнтнческн важного основання в активном центре, а рК, = 9,1 — ноннзацнн а-амнногруппы Ие-16, которая в протоннрованном состоянии стабнлнзнрует каталнтнческн активную конформацню фермента. Эта важная в конформацнонном отношении ионизация не влияет на рН.завнснмость й„ь для которой обычно характерна снгмондная кривая с рК, 6 — 7, но приводит к увеличению Км прн высоком рН.
1. рК, активного центра химотрнпснна а Свободный фермент Теория предсказывает, что если прн изменении рН не происходит изменения природы лимитирующей стадии, то рН-завнснмость А„~/Км для всех неноннзнрующнхся субстратов даетзна- ГЛАВА 6 666 Ь, ;го ь- Рис. В.б. Аномально ивз. иое значеыие рКм кото. рое получается из рН-за.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
