Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 25
Текст из файла (страница 25)
(Для стационарной кинетики константа скорости обычно включает экспоненциальный член, не зависящий от концентрации фермента, тогда как для стационарной кинетики константа скорости прямо пропорциональна концентрации.) Часть 2. ПОРЯДОК ВЕЛИЧИН КОНСТАНТ СКОРОСТИ ДЛЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ А. Верхний предел констант скорости 112] 1. Ассоциация и диссоциация Для анализа констант скорости химических реакций лучше всего использовать теорию столкновений. Константа скорости бимолекулярной реакции представляет собой произведение трех сомножителей: частоты соударений У, стерическога фактора р, равного доле молекул, имеющих необходимую ориентацию, и экспоненциального члена, в который входит энергия активации и который равен доле молекул, обладающих достаточной энергией: Аз = гр ехр ( — ЕА]НТ).
(4.80) Когда энергия активации равна нулю, а стерический фактор— единице, константа скорости бимолекулярной реакции имеет максимальное значение. В таком случае говорят, что скорость процесса лимитируется диффузией и равна частоте межмолекулярных столкновений, Предположив, что реагирующие молекулы представляют собой незаряженные сферические частицы радиусами г, и гь, мы можем рассчитать частоту столкновений по следующей формуле: г= (заг1зоеоч) (., + Гь) ]г;ь, (4,81) ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ [57 где т[ — вязкость среды.
Для двух молекул одинакового радиуса частота соударений в воде при 25'С равна 7 10з М-'с †'. Следует отметить, что две большие молекулы сталкиваются точно с такой же частотой, как и две малые. Это обусловлено тем, что увеличение площади мишени точно компенсируется уменьшением скорости диффузии крупных молекул. Однако частота столкновения небольшой молекулы с большой выше частоты для двух предыдущих случаев, поскольку имеют место оба упомянутых фактора — увеличение площади (за счет большой молекулы) и увеличение подвижности (за счет малой).
Более сложные расчеты, учитывающие с одной стороны электростатическое взаимодействие между молекулами, которое увеличивает частоту соударений, а с другой — влияние геометрии небольшой молекулы на частоту ее столкновения с молекулой большого размера, дают диапазон частот 1О' — )ОИ М-'с-'. Аналогичным образом устанавливается верхний предел для констант скорости диссоциации бимолекулярных комплексов — 10' — 10" с-'. Экспериментально показано, что многие константы скорости второго порядка для реакций, протекающих без участия протонов или гидроксил-ионов, имеют величину порядка [ОР М-' с †'. 2. Химические процессы Верхний предел для констант скорости любых моно- или внутримолекулярных реакций равен частоте молекулярных колебаний — 10" — 10" с-'.
(4.83) 3. Перенос протона Перенос протона между такими электроотрицательными атомами, как О, [ч или 8, совершается чрезвычайно быстро. Бимолекулярные реакции обычно лимитируются диффузией, и константы скорости имеют порядок 1О" — 1Он М-'с-' (табл.4.!). Например, константа скорости переноса протона от Н,О+ на имидазол, который является более сильным основанием, чем Н~О (и потому такой перенос благоприятен), равна 1,5 [ОММ-' с-'. Константу скорости обратной реакции — переноса протона от имидазолий-иона на молекулу воды — можно вычислить из разности рК, этих соединений с помощьюследующих уравнений: )В) [Н'! К [А ] [Н'] К . [вн'] ' [нА] [В) [НА) 7 [ВН+] [А-] -"А7"А' [В]+ [НА] ч==~ [ВН+]+ [А ], (4.84) 158 ГЛАВА о Таблица С1 Константы скорости переноса протона, М ' с ', 25 еС а! он н Н+ н 1,4 1О" 1010 10о ОН Аиноны неорганических кислот Карбоксилаты 1О" !О~о Неорганические кислоты Карбоксильные кислоты Фенолы Еиолы Ионы аммония Карбонояые кислоты Фосфорные кислоты 5 1Ом 5 .
10~о 5 1Ом 10!о ( 1 — 101о !О~о 1Ом 3 1Ом < 1 — 10о 10' — 10'о Феноляты Еноляты Амины Карбанионы М И!иеп М., Ноье! Бу~папо1ппь а, ЯЬ (1ЯЕ11. откуда А-П'А! Ка/Ка. (4.85) Рассчитанная таким образом константа скорости переноса протона от нмидазолий-иона (рК,=6,95) на молекулу воды ((НаО) 55 М, рК, = — 1,74) равна 1,7 !Оо с-'. Перенос протона от карбоновых кислот на карбоновые основания обычно происходит гораздо медленнее. Обусловлено это тем, что более низкая электроотрицательность углеродного атома требует стабилизации отрицательного заряда на карбоновом основании путем делокализации электрона, Последующая перестройка структуры и влияние растворителя могут замедлить результирующую скорость переноса.
Одно время считалось, чтоскоростьустановления равновесия между кислыми и оснбвными каталитическими группами фермента и растворителем устанавливает верхний предел числа оборотов для катализируемых кислотами и основаниями реакций, равный 1Оа с-1. Объяснялось это тем, что константа скорости переноса протона от нмидазолий-иона на молекулу воды и от воды на имидазол составляет 2 1Оо с-'. Однако перенос протонов между имидазолом или имидазолий-ионом и молекулами буфера в растворе совершается с константамн скорости, вомного раз превышающими указанную величину.
Например, в случае АТР, рКа которого равен рА; имидазола, константа скорости составляет -1Оо М-1 с-1 (при концентрации АТР в клетке около 2 мМ). Имеется и ряд других метаболитов, присутствующих в клетке в миллимолярных концентрациях, которые содержат соответствующие кислые и оснбвные группы, в результате чего измвранна констант скорости онрмннт«тинных рв«кцин 159 равновесие между каталитическими группами фермента и растворителем может устанавливаться со скоростью !О' — )05 с-' илн выше. Числа оборотов ферментов обычно существенно ниже этого значения — они лежат в диапазоне !Π— !О'с — ', хотя число оборотов карбоангидразы и каталазы равно 105 и 4 !От с — ' соответственно. Свойства карбоангидразы рассмотрены в гл. !2, равд.
Е. Таблица 4.2 Константы скорости переноса протона на нмидазол н от имнлазолнА-попа (РК = 6,95) а!1121 «(1ми'+ П), М е с «(ОН'-ь1 ). и' -' с (' ° онов он') рк а! т 55'С ноннав сила О. Скорость в случае псе рассчвтана нрн )па01 55 М. Б. Константы скорости ферментативных реакций и лимитирующие процессы 1. Ассоциация ферментов и субстратов Согласно расчетам, лимитируемые диффузией частоты столкновений фермента и субстрата должны быть порядка 10' М-' с-'. Приведенные же в табл. 4.3 наблюдаемые частоты в основном лежат в интервале 10' — )О'М-'с — '.
Наиболее высокие значения приближаются к величинам, лимитируемым диффузией, но самые низкие лежат существенно ниже этого предела. В одних случаях это может быть обусловлено необходимостью десольватацни, в других (что более вероятно) — тем, что процесс на самом деле является двухстадийным, а считается одностадийным. Например, прн низких концентрациях лнзоцим связывает Р)АОт с константой скорости -5 !05 М-'с-'.
Однако измерения при более высоких концентрациях показывают, что связывание н о' НаО сн,со н НАТР н-Ннтрофеиол НР О Фенол со',- Глюкоза -1,74 15,74 4,76 6,7 7,14 8,45 9,95 10,33 12,3 1,5 1О'о 45 1,2 1Оа 2 10с 4,5 ° 1Ов 1,1 1Оа 1 ° 10' 1,9 ° 1От 1,6 1Ов 31 2,3 ° 1О'е 7,7 1Оа 1 ° 1Ос 7,0 1Оа 3,6 ° 10' 1 ° 1Ово 2 ° 1О'е 2 ° 1О'о ГЛАНА 4 Таблица 4.3 Константы скорости ассоциации и днссоциации фермент-субстратнмк комплексов в -! с ав, ! †! -! с Источник денника) Субстрат Фермент Небольшие лиганды Каталаза Каталаза-НтОв Химотрнпсин 5 ° 1Ов 1,5 1О' 1,2 10в б 10' 8,3 10' б ° 10' б,2 ° 10в 1,5 10' 1,8 1О' 5,1 ° 1О' 1.
1Ов 2,1 1О' 2,2 1О' 5,3 10в 1,9 10' 1 4 ° 10' Креатинкиназа 1О' МАОН 10в 39 17 5,5 ° 1От 8,1 ° 1Ов 2,5 1О' МАОН Окса мат 1О МАОН 1 ° 1О' 50 4 1О' б ° 10в 11, 12 13 (МАО)т МАРН Пируват 2,1 1О' 1,1 1О" 2 ° 10' 14 45 Гбе 7,8 1О' 1 10' Урндин-3'фосфат Уридин-2', 3'-цикла. фосфат 1б 15 24 2,4 1О' Тиранил-тРНК— сиитетаза 17 Тирозин Валок †нуклеино- выв кислоты тРНК " 1,8 !Ов Фенилаланнл- тРНК-синтетава Сернл-тРНК- синтетаза Тиранил-тРНК- синтетава 18 тРНКзет тРНКТУ' 21 10' 2,2 10' 1,4 ° 1О' 1,б 58 20 Глицеральдегид- 3-фосфат †дегидрогеназа Лактатдегидрогеназа (из мышц кролика) Лактатдегидрогеназа (из сердца свиньи) Алкогольдегидрогеназа печени Ливоцим Малатдегидрогеназа Пируваткарбоксилаза-Мп ' Рибонунлеаза НО, НО Профлавнн н-Ннтрофениловмй вфир ацетил-).-триптофана Фурнлакрилоил-1..
триптофанамид ТрифторацетилО.триптофан АОР МКАОР МАО ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ !6! Продолжение 3 с -! Источник лепных в> 3(, М 'с ' Субстрат Белок — белок 6,6 ° 1О 86 !О-' 11,!Ов 7,7 ° 10з Осндиный панкреати. ческий ингибитор трипсина Ппнкрватичвский се«реторный икгибитор трипсина Инсулин 6-Лактоглобулии а-Хнмотрипсип Трипснн Лнгндротриксин 21 21 2,2 ° 1О 1,4 1О 6,8 10з 4 ° 1Ов 21 21 Трнпсин Ангидротрипсин 1,6 ° 104 2,1 0,68 1,2 ° 1Ое 4,7 1О' 8,7 ° 10Е Инсулин 6-Лвктоглобулнн а-Хнмотрнпсин 22 22 22 ! — СЬапсе В.
!п'. Сиггеи!в )и ЫосЬепкса! гевеагсЬ (ее, Огееи О. В.), лоьп Игпеу, р, ЯЯВ ()936). 2 — Опав! Н., Виве! Л, Непаапп Н., Кгаизе О., 5!еиеп Е., В)осью>э!Еу, !3, 26Ы ()974).  — йепагб М., Регэы А, й., В)ось ю!энт. ! К 47)3 ()973>. 4 — Йеэв О. Р., МсСопп 7., Ки Е., МсСопвеу О., РЫ!. Тгапв. й. вос., Вжг, 39 (!97вь б — Бгпа!!сотЬе 8. Н., Аии В., й!сЬагез А Н., А Ат. ЕЬеис зос., Ы, 6663 ()973), б — Йапппев О. О., Нйю! А К., ВысЬеги!в(гу, В, НЮ ()Ябв. 7 — К!ысьпег К., Е)кеи М., ВЙ!пап й., Уо!6! В., Ргос. па!и. Асав. вс!., О, 8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
