Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Основы фсрментативноа кинетикн.— Ма Мир, !979.) 15, С!е(апз( ЯГ. Эг., ТЬе Епвувев, 2, 1 (1970). 16. Ва!ме! К., ТЬе Епвувев, 1О, 2 (!975). !7 Уепсьз ЕГ. Р., Сгеззег М., Уа!епгиг1а М. В., Нипееиз К С., У. ЬЫ1. СЬепз., 247, 3756 (1972). Глава ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ И ПОРЯДОК ИХ ВЕЛИЧИН Часть 1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ: КИНЕТИКА ПЕРЕХОДНЫХ ПРОЦЕССОВ Кинетические исследования ферментативных реакций, протекающих в стационарных условиях, обычно позволяют определить только два параметра: константу Михаэлиса Км, которая может быть равна константе диссоциации фермент-субстратного комплекса, и й,.ь в одних случаях представляющую собой микроскопическую константу скорости, а в других — комбинацию констант скорости для нескольких стадий.
В распоряжении исследователя имеется ряд приемов, которые при случае можно использовать для выявления промежуточных соединений и даже для измерения индивидуальных констант скорости, однако это удается сделать далеко не всегда и зависит от механизма реакции. (Несколько примеров такого рода будут рассмотрены в гл. 7.) Чтобы найти константы скорости отдельных стадий и обнаружить «короткоживущие> промежуточные соединения, необходимо измерить скорость приближения системы к стационарному состоянию, Индивидуальные константы скорости могут быть измерены за промежуток времени, в течение которого устанавливается это состояние. Поскольку значения й.,~ лежат в интервале 1 — 1О' с-', измерения следует проводить за время от 1 до 10-' с.
Для этого требуется либо аппаратура для быстрого смешивания и после. дующего наблюдения за ферментом и субстратом, либо особые, совершенно новые методы. Кроме того, поскольку наблюдаемые события происходят на самом ферменте, этот фермент должен присутствовать в количествах, сравнимых с количеством субстрата. Создание приборов для исследования быстрых реакциий и разработка методов выделения больших количеств белка в чистом виде произвели настоящую революцию в ферментативной кинетике. Ниже мы рассмотрим два метода исследования быстрых реакций. Первый из них — метод быстрого смешивания реагентов, который позволяет смешать два раствора за доли миллисекун- ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ !з! ды, в то время как число оборотов большинства ферментов составляет 1000 с — '.
Второй — метод релаксачаонной кинетики. Проблема мертвого времени, связанного со смешиванием реагентов, здесь отсутствует благодаря использованию предварительно смешанных растворов. Л. Методы быстрого смешивания реагентов и быстрого «замораживания» реакции 1. Метод непрерывной струи В !923 г. Хартридж и Роутон при исследовании присоединения лигандов к дезоксигемоглобину применили метод непреывной струи [1[. Принцип этого метода иллюстрирует рис. 4.1. ва шприца соединены через сместитель с реакционной трубкой.
Екерюиь слррм =хм«« Рис. 4.!. Схема устройства, используемою в методе иепрерывиой струи. Один шприц заполняется раствором фермента, другой — раствором субстрата; оба раствора продавливаются с постоянной скоростью и тщательно перемешиваются в смесителе, а затем поступают в трубку и «старятся». При постоянной скорости струи «возраст» раствора прямо пропорционален пути, пройденному им в трубке, и скорости струи.
Например, если скорость струи равна 10 м.с-', то на расстоянии 1 см от смесителя «возраст» раствора будет равен ! Мс, на расстоянии 1О см — 10 мс и т. д. Скорость протекания струи следует поддерживать выше критической, чтобы гарантировать турбулентность потока. Ниже этого критического значения, равного для трубки диаметром ! Мм приблизительно 2 м с-', поток может стать ламинарным и жидкость в центре трубки будет течь быстрее, чем у стенки, Тем самым устанавливается верхний временной предел для трубки данной длины.
2. Метод остановленной струн Этот метод был разработан в 1934 г. Роутоном [2] и значительно усовершенствован шестью годами позже Чансом [3[. Лежащий в его основе принцип иллюстрирует рис. 4.2 [4[. !зй ГЛАВА Ь В отличие от описанного выше метода непрерывной струи здесь поршни обоих шприцев объемом по 50 — 200мкл каждый быстро приводятся в движение и затем механически останавливаются.
Предположим, что мы наблюдаем за точкой, находящейся от смесителя на расстоянии 1 см. Если скорость струи равна 10м с-', то за время существования непрерывнога потока «возраст» раствора в этой точке будет равен ! мс, После остановки струи происходит старение раствора и детектор регистрирует Ц ~ ~ Моиолролилтр Миировььклютоливль 0оиилловра1о Рис. 4.2. Схема устройства, используемого в методе остаиовлеииой струи. события, совершающиеся по прошествии 1 мс. Возраст раствора в момент начала регистрации называется мертвым временем прибора.
Метод остановленной струи является рутинным лабораторным методом, тогда как метод непрерывной струи используется только в особых случаях. Для проведения всего цикла измерений с помощью метода остановленной струи достаточно 100— 400 мкл раствора, при этом мертвое время составляет около 0,5 мс, а время регистрации может достигать нескольких минут (при наличии соответствующей аппаратуры). Применение метода непрерывной струи требует очень больших объемов, а регистрация должна проводиться только в течение 100 мс, поскольку работать с более длинными трубками очень сложно. Дополнительные трудности связаны с тем, что сканирование должно проводиться по всей длине трубки. Помимо проблем чисто технического плана, это ставит ряд принципиальных вопросов, в частности увеличение систематической ошибки в связи с неоднородностью размеров трубки и несовершенством ее термостатирования.
Зато метод непрерыв- ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 133 3. Метод быстрого «замораживания» струи Чтобы не пользоваться для регистрации фотоумножителями или другими детекторами, растворы можно «заморозить» (на- иоалгоРагкаюаюиви реагенпг Пв од ьсе кррваины Зля ваполнвния аеп,ванов 11еуниодньге каины для пролгыв нии игприаов ервьгй ееингаеь О,Рви оипгвль К каглекпгора Рис. 4.3. Схема устройства, исаольауемого в методе «ааморожеииой» струи. пример, добавив трихлоруксусную кислоту) и анализировать продукты реакции хроматографическими или какими-либо ины- ми методами. ной струи имеет меньшее мертвое время — всего 100 — 200 мкс, поскольку отсутствуют трудности, связанные с механической остановкой струи; остановка происходит за доли миллисекунды и может привести к возникновению ударных волн, если осуществляется слишком резко.
Второе преимушество данного метода состоит в том, что можно использовать инерционные детекторы, так как в каждой данной точке трубки возраст раствора постоянен. Этот фактор играл особенно большую роль в экспериментах Хартриджа и Роутона, которые использовали в качестве детектора ручной спектроскоп1 ГЛАВА ь 134 а. «Замороженная» струя В простейшем варианте этот метод состоит в том, что конец реакционной трубки, используемой в методе непрерывной струи, погружают в сосуд с кислотой.
Несколько более усовершенствованный вариант изображен на рис. 4.3. В этой установке имеется рви нжер Перехедньсе кссаны Пвя еанолнейия силрис4вв Первьсй всиееитась урувка ~ккаиекюуйс Пея инкрдании Рис, 4.4. Схема устройства, используемого в импульсном методе «заморожен- ной» струи. шприц с кислотой, которая смешивается с растворами реагентов во втором смесителе. Мертвое время устройства может составлять всего 4 — 5 мс. Однако максимальное время измерения при использовании малых объемов реагентов составляет около 100 — 150 мс; для его увеличения необходимы очень длинные реакционные трубки.
б. Импульсный метод замороженной струи Временной интервал, в течение которого можно проводить регистрацию методом замороженной струн, может быть расширен с помощью приема, используемого в методе остановленной струи Ц. Как видно из рис. 4.4, сначала фермент и субстрат измяряния констант скорости Фяпмянтдтнвных пяакции 1ЗВ смешивают и переводят в инкубационную трубку плунжером, приводимым в движение сжатым воздухом, а затем по прошествии некоторого времени (150 мс или больше) инкубируемую смесь вместе с порцией дистиллированной воды переводят вторым плунжером во второй смеснтель, где и «замораживают».
Б. Релаксацнонные методы 1. Метод температурного скачка Время перемешивания растворов налагает ограничения на мертвое время струевых методов. Единственный способ увеличить временнбе разрешение состоит в том, чтобы исключить Врвмя Рис. 4.5. Диаграмма, иллюстрирующая приииип метода температуряого скачка. смешивание и, имея равновесную смесь уже инкубнрованных реагентов, измерить каким-либо способом константы скорости. Наиболее общий подход к этой проблеме состоит в использовании релаксационного метода. Систему выводят из состояния равновесия, а затем измеряют скорость установления нового равновесия (релаксация), Например, в методе температурного скачка [б] (рис.
4.5) раствор инкубируют в кювете спектрофотометра или флуориметра, а затем менее чем за 1 мкс повышают его температуру на 5 — 10' с помощью разряда конденсатора (в самых последних установках за 10 — 100 нс с помощью инфракрасного лазера). Если при этом изменяется энтальпия системы, 1за ГЛАВА 1 то смещается и положение равновесия.
Переход системы к новому равновесию характеризуется в общем случае набором времен релаксации т. Ясно, что к системам, в которых протекают необратимые химические процессы, этот метод не применим. Наиболее ценен он для исследования простого связывания лигандов (например, связывания 1чАР+ с дегидрогеназой, связывания ингибиторов) или для исследования конформационных изменений в белке, Предпринимались попытки объединить метод температурного скачка с методом остановленной струи.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
