Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 18
Текст из файла (страница 18)
В честь ученого, который ввел это понятие, комплекс субстрата с ферментом, образованный без участия ковалентных связей, часто называют комплексам Михаэлиса. ОСНОВНЫЕ УРАВНЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОИ КИНЕТИКИ !)3 Поскольку константа диссоциации комплекса Е3 равна Кл = = л 4/йз, то КМ Кз+ 2/ Г (3.16) Естественно, что при й 4')) й, уравнение (3.14) сводится к виду Км = Кз, т. е.
константа Михаэлиса представляет собой в этом случае константу диссоциации фермент-субстратного комплек- са. б. Промежуточное соединение, образующееся вслед за образованием Е8: Км < К5 Кз К К Аз Е+ $ ~~н ЕЗ ч==~ ЕЗ' ч==~ Ебн — » ЕР, (3.16) Медленно где [Е3'] = К[Е6], а [Е3"] = К'[ЕБ]. Следовательно, Км= Кздз+ К+ КК ) и Й„з=ьеКК)() + К+ КК~). (3.17) (3.18) Катализируемый химотрипсином гидролиз эфиров и амидов протекает согласно следующему механизму: Кз 44 Аз Е+ 3 ~~ Ез — -з ЕА ' ЕРз, Рз (3.19) где ЕА — «ацилфермент», Считая, что концентрация комплекса ЕА стационарна, мы можем записать Азьз/(Ьз + Аз) "=[Е] [6](~,,~(,~~,) 11 (3.
20) Схему Михаэлиса — Ментен можно использовать для анализа самых разных процессов, отличительной особенностью которых является образование в ходе реакции дополнительных ковалентно или нековалентно связанных промежуточных соединений. Установлено, что во всех этих случаях применимо уравнение Михаэлиса — Ментен, хотя теперь Км и й,.з представляют собой комбинации различных констант скорости и констант равновесия. При этом всегда Км < К5. Допустим, например, что реакция протекает с образованием ряда промежуточных соединений [схема (3.16) ] и конечная каталитическая стадия является медленной: ГЛАВА 3 !14 г. е.
получаем уравнение Михаэлиса — Ментен, где Км = КзМ(ьг + /«з) (3.21) Аса« = А«А«/(Аз + ~з) (3.22) или 1/А„« = 1/А + 1/А . (3.23) В более сложных случаях неравенство Км ~ Кз может не вы- полняться. 4. Все три механизма встречаются на практике В случае механизма Бриггса — Холдейна, для которого йз » й ь отношение й..«/Км равно й« вЂ” константе скорости связывания фермента и субстрата. В гл. 4 будет показано, что константы скорости связывания должны быть порядка 1О' М-'с-'. Это позволяет сделать вывод, что для механизма Бриггса — Холдейна отношение й .«/Км равно -10'— 10' М-'с-'. Каталаза, ацетилхолинэстераза, карбоангидраза, кротоназа, фумараза и триозофосфатизомераза — все эти ферменты по указанному критерию подчиняются кинетике Бриггса — Холдейна, о чем свидетельствуют данные табл. 4.4. Еще одним ферментом такого типа является пероксидаза, выделенная из хрена,— один из первых ферментов, к которому были применены методы исследования быстрых реакций ]3].
Сначала пероксидаза образует с перекисью водорода компекс Михаэлиса, который затем взаимодействует с донором водорода (реакция второго порядка). При достаточно высоких концентрациях донора скорость второй реакции значительно превышает скорость диссоциации комплекса Михаэлиса. Образование вслед за фермент-субстратным комплексом промежуточных соединений !как в схеме (3.19)] — чрезвычайно широко распространенное явление. Однако в случае физиологических субстратов эти промежуточные соединения часто не накапливаются и медленной стадией в последовательности реакций (3.19) является стадия с константой скорости /««. (Обусловлено это причинами принципиального характера, обсуждающимися в гл.
1О, где приведены соответствующие примеры.) При этих условиях Км равна Кз (константе диссоциации) и первоначально предложенный механизм Михаэлиса — Ментен оказывается всегда выполнимым /)ля многих экспериментальных систем наблюдается обратная картина. Исследователи часто используют в опытах синтетические высокореакционные субстраты; в этих условиях часто происходит накопление содержащих ковалентные связи промежуточных соединений. 115 ОснОВные уРАВнения ферментАтиВнон кинетики Б. Физический смысл параметров уравнения Михазлиса — Ментен 1.
Смысл константы й„! Когда имеется только один фермент-субстратный комплекс и все стадии связывания достаточно быстрые, параметр й,.! в уравнении Михаэлиса — Ментен представляет собой просто константу скорости первого порядка для химического превращения комплекса ЕЗ в комплексе ЕР. В более сложных ситуациях й„! является функцией всех констант скорости первого порядка и не может быть отнесена ни к какому конкретному процессу, за исключением крайних случаев. Например, для механизма Бриггса — Холдейна, когда комплекс ЕР диссоциирует достаточно быстро, й„! = й, [уравнение (3.10)]. Однако если диссоциация комплекса ЕР протекает медленно, то константа скорости этого процесса вносит вклад в параметр й„! и в предельном случае, когда скорость диссоциации ЕР значительно меньше скоростей химических стадий, параметр й„! будет равен константе скорости диссоциации.
Из рассмотрения схемы (3.19) видно, что в этом случае й„! является функцией констант йт и йь Однако если одна из этих констант много меньше другой, й,.! становится равной меньшей константе. Например, если яз « йм то, согласно (3,22), йсв! = Йм Из этого следует, что йса! не может превышать ни одной из констант скорости первого порядка для реакционного пути в прямом направлении и представляет собой, таким образом, нижний предел для констант скорости химических реакций. Часто параметр й,.! называют числом оборотов фермента, поскольку он определяет максимальное число молекул субстрата, превращающихся в продукт одним активным центром в единицу времени.
2. Смысл К„г истинные и кажущиеся константы равновесия Несмотря на то что Км равна Кз — истинной константе диссоциацни фермент-субстратного комплекса — только для простого механизма Михазлиса — Ментен или в аналогичных случаях, при решении определенных задач Кн можно рассматривать как кажущуюся константу диссоциации. Например, концентрацию свободного фермента можно рассчитать из соотношения (3.24) ))в Г'ЛАВА 3 где ~ [ЕЯ] — сумма концентраций всех фермент-содержащих форм '. Концепция кажущихся величин очень плодотворна и используется во многих случаях, например при определении рК,. Довольно часто значения РК, не отражают микроскопическую ионизацию данной группы, а представляют собой комбинацию соответствующей константы с константами равновесия между разными конформационными состояниями данной молекулы.
Эту кажущуюся константу можно определить титрованием как простую константу рК.. При анализе влияния температуры, рН и других факторов на кажущуюся Км не следует слишком полагаться на подобный упрощенный подход; необходимо помнить, что константы скорости, функцией которых является кажущаяся константа Км, также зависят от указанных факторов. То же самое относится к значениям й,.г. В литературе имеются примеры, когда наличие изломов на температурной зависимости й„г объяснялось тем, что фермент претерпевает конформационные изменения, тогда как в действительности имела место разная температурная зависимость индивидуальных констант скорости, входящих в параметр й„г, т.
е. констант йз и йз в уравнении (3.22). То, что Км является мерой количества фермента, связанного в той или иной форме с субстратом, иллюстрируется следующей схемой (сравните с механизмом действия химотрипсина): к, ьз зз Е+ 5 «~==~ Е5 — » ЕЗ' — » Е+ Р Применяя условие стационарности к комплексу Е8', получаем (Е5') = (ЕЗ) йз/йз- (3.26) Когда йз))йз, [ЕЯ'] намного превышает [ЕЯ), так что ЕЯ' вносит в Км больший вклад, чем ЕЯ, и является преобладающей ' Любопытно, что кинетика Михазлиса — Ментен может наблюдаться и в отсутствие насыщения фермента субстратом. Рассмотрим, например, следующую схему: «! Е+5 — ' Е'+Р, Здесь взаимодействие активной формы фермента с субстратом представляет собой реакцию второго порядка; в результате образуются продукты и неактивная форма Е', которая медленно переходит в активную.
Этот случай служит примером кинетики с кажущимся насыщением; при ятом й,.г = й», а Км = яз/йь Если рассматривать Е' как «связанную» форму фермента, то можно применять уравнение (3.24). ОС!!ОВНЫЕ УРАВНЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОН КИНЕТИКИ 117 ферментсодержащей формой. Даже не решая написанных уравнений, мы интуитивно чувствуем, что Км должна быть меньше Ка приблизительно в йз/йа раз, т. е. К м — Кз (~а/Ах)' 3. Смысл параметра /з„с/К Как было показано ранее !уравнение (З.З)], скорость реакции при низких концентрациях субстрата определяется уравнением О = (йса!/Км) [Е] а [3], т.
е. Отношение йса!/Км представ" ляет собой кажуи(уюся константу скорости второго порядка. Этот параметр не является истинной микроскопической константой, за исключением крайнего случая, когда реакция лимитируется столкновением фермента с субстратом. Ценность параметра й„с/Км состоит в том, что он связывает скорость реакции с концентрацией свободного фермента, а не с его общей концентрацией. В этом нетрудно убедиться из рассмотрения приведенного выше уравнения (3.3), поскольку при низкой концентрации субстрата фермент находится преимущественно в свободном состоянии ( [Е] — [Е] а), и, следовательно, скорость реакции есть "=!а)!З)А а/Км В.
Графическое представление данных Для графического анализа данных и обнаружения отклонений от идеальности весьма полезно преобразовать уравнение Михаэлиса — Ментен в линейную форму. Чаще всего для этого используют метод Лайнуивера — Бэрка. Взяв величины, обратные правой и левой частям уравнения (3.1), и подставив выражение (3.2), мы получим уравнение Лайнуивера — Бэрка [5]! тах + Км/ хааа ! ! (3.28) Ниже будет показано !уравнение (3.41)], что этот вывод справедлив для любой концентрации субстрата. Мы покажем также [уравнение (ЗХ4) ], что параметр й,.с/Км определяет специфичность действия фермента при наличии конкурирующих субстратов.
Отношение й:с/Км не может превышать ни одну из констант скорости второго порядка [4] для последовательности реакций, идущих в прямом направлении, и представляет собой, таким образом, нижний предел для константы скорости при связывании фермента с субстратом. 118 глава а График, построенный в координатах [1/[3]; 1/о) (рис. 3,2), представляет собой прямую, тангенс угла наклона которой равен Км/У „, отрезок, отсекаемый на оси ординат (при 1/[3] = О), есть 1/К„ак, а на оси абсцисс — 1/Км. Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
