Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 15
Текст из файла (страница 15)
В этом состоит принцип кинетической эквивалентности. Например, двум приведенным ниже механизмам обобщенного основного катализа соответствуют одинаковые уравнения скорости реакции: СН,С вЂ” ' //род~клГз4 (О ОЕГ А1Н~ ~Н (2.77) ~~ ОтНА — 1 ~ррдлклГы нО Оет (2.78) Для реакции (2.77) и Аи [А ][Эфир], (2.79) Для реакции (2.78) и — Я[НА][ОН ] [Эфир] =Ай [А [[Эфир] К„/Ки= Ай [А ] [Эфир]. (2.80) (2.81) (2.82) Уравнения (2.79) и (2.82) эквивалентны, и эти два механизма невозможно различить, анализируя концентрационную или рН-зависимости скорости реакции.
Данные механизмы нельзя различить и по знаку коэффициента Бренстеда 8 при варьировании рК, катализатора. Интуитивно это ясно, поскольку обе реакции сопровождаются делокализацией отрицательного заряда в переходном состоянии, но данный вывод можно обосновать и математически. Механизму (2.77) соответствует положитель- Концентрация кислоты связана с концентрацией сопряженного ей основания и протона. В связи с этим ответить на вопрос, что представляет собой переходное состояние реакции, зависящей от конпентрации НА,— недиссоциированную кислоту или комбинацию протона с сопряженным основанием,— невозможно. Аналогичным образом, поскольку концентрация основной формы связана с концентрацией гидроксил-иона и кислоты с помощью уравнения эб химическии кхтхлиз ное значение коэффициента В, поскольку, чем сильнее основание, тем эффективнее будет катализ. Механизму (2.78) также соответствует положительное значение р, так как, хотя общему кислотному компоненту соответствует отрицательное значение р, наличие члена 1/К, в уравнении (2.81) означает, что к !и о следует прибавить слагаемое 1 рК„ с избытком компенсирующее тот небольшой по значению отрицательный коэффициент р, который соответствует химической стадии.
Кинетически эквивалентные механизмы можно различить в том единственном случае, когда один из них включает «невозможную» стадию, например когда константа скорости реакции второго порядка превышает то предельное значение, которое характерно для реакции, лимитируемой диффузией, либо когда в результате расчета получается отрицательная энергия активации [скажем, в случае гидролиза аспирина; схема (2.78)[ [12[. Ж. Кинетические изотонные эффекты [571 Иногда информацию о глубине протекания и природе стадий образования и разрыва связей в переходном состоянии удается получить, изучая влияние изотопного замещения на скорости реакций. Эти эффекты можно разделить на два класса в зависимости от положения замешенных атомов.
1. Первичные нзотопные эффекты Первичный изотопный эффект наблюдается при расщеплении связи у замешенного атома. Например, часто связь С вЂ” О расщепляется в несколько раз медленнее связи С вЂ” Н. Менее заметное уменьшение скорости (на несколько процентов) обнаруживается иногда при замещении 14Х на 151ч или "О на "О. Степень изменения скорости позволяет судить о степени разрыва связи в переходном состоянии. Для анализа изотопных эффектов проще всего сопоставить ферментативную реакцию с простой модельной системой, химические свойства которой изучены другими методами. В этом разделе нас интересуют в первую очередь эмпирические результаты модельных экспериментов, однако рассмотрение теоретических основ этих эффектов (даже в упрощенном виде) весьма полезно для понимания их природы, На рис.
2.8 представлена характерная зависимость энергии связи между атомами углерода и водорода от расстояния между этими атомами. Точно такая же зависимость имеет место и для атомов углерода и дейтерия, поскольку форма кривой определяется орбитальными электронами. Согласно квантовой теории, самый низкий энергетический йв ГЛАВА Э уровень, т. е. нулевой ароеень энергии, располагается выше дна ямы на величину '/хйч. где о — частота колебаний. Ее можно найти из инфракрасных спектров соединения.
Нулевым энергетическим уровням для связей С вЂ” Н и С вЂ (э отвечает энергия 17,4 и 12,5 кДж моль-' (4,15 и 3 ккал моль-') соответственно. Если в переходном состоянии атом водорода или дейтерия находится Расстсянае лгеясф атаиалги С а Н али бай Рис. 2.8. Изменение энергии при переносе водорода или дейтерия от атома углерода. Энергия переходного состояния в обоих случаях имеет одно и то же значение (зтот вопрос обсуждается в тексте), однако в исходных веществах водород имеет более высокую энергию вследствие более высокой нулевой энергии. Следовательно, энергия активации при переносе водорода ниже, чем при переносе дейтерия. на вершине энергетического профиля; а не в яме, то в переходном состоянии данной реакции отсутствует нулевой уровень энергии. Следовательно, разорвать связь С вЂ” Н при 25' в 7 раз легче, чем связь С вЂ (э [это соответствует разности энергий нулевых уровней (17,4 — 12,5) кДж моль-' (4,15 — 3,0) ккал моль-'].
На самом деле кинетический изотопный эффект может быть больше за счет квантовомеханического туннельного перехода или меньше, поскольку в переходном состоянии имеют место компенсирующиедеформационныеколебания. Как правило, если полученные значения лежат в интервале от 2 до 15, это означает, что в переходном состоянии происходит разрыв связи С вЂ” Н. В гл. 12 (равд.
А.1) будет показано, что для переноса гидрид- химический кАтАлиз 97 иона между субстратом и НАР+ в реакциях, катализируемых алкогольдегидрогеназой, отношение йн/йо равно 3 — 5. Кинетические изотопные эффекты с применением кислорода и азота использовались для выяснения природы лимитирующей стадии в реакциях, катализируемых химотрипсином и папаином. Для катализируемого щелочью или общим основанием гидролиза метилформиата [НС(=О) нх "ОСНв] в модельной системе отношение йм /йпо —— -1,01.
В случае гидразинолиза, где лимитирующей стадией является распад тетраэдрического промежуточного соединения, величина изотопного эффекта равна 1,062. в- Р .У Н вЂ” С вЂ” Н вЂ” С в,' " Н4:)~-г ОМе НО ОМе ПС (2.83) Г,О' Н вЂ” С' ,/ '. вНг1ч(ЧНг ОМе ПС Н вЂ” С У', ОМе (2. 84) Эти величины можно сравнить с величиной 1,052 для случая отсутствия нулевого энергетического уровня в переходном состоянии [58). Кинетические изотопные эффекты, обнаруженные при гидролизе эфирных субстратов, катализируемом химотрипсином, близки к эффектам, характерным для гидролиза метилформиата, катализируемого общим основанием [59). Это означает, что лимитирующей стадией является, по-видимому, образование тетраздрического промежуточного соединения. Катализируемый папаином гидролиз бензоил-( -аргининамида характеризуется кинетическим изотопным эффектом (44Н/гв(Х)) около 1,024, что близко к верхнему пределу (1,01 — 1,025) для расщепления связи С вЂ” Н [60), найденному в модельных опытах.
Этот факт означает, что в переходном состоянии связь С вЂ” )Х) в значительной мере расщеплена и скорее всего объясняется тем, что лимитирующей стадией является распад тетраэдрического промежуточного соединения (гл. 12, равд. Б.2). Кинетический изотопный эффект для атомов азота (1,006— 1,01), наблюдаемый при катализируемом химотрипсином гидро- лизе амида апилтриптофана, авторы работы [61] рассматривали как доказательство того, что в лимитирующую стадию вносит вклад как образование, так и разрушение тетраэдрического промежуточного соединения. 98 ГЛАВА В 2.
Вторичные изотопные эффекты Вторичные изотопные эффекты наблюдаются при расщеплении связи между атомами, соседними с замещенным на другой изотоп атомом. Эти эффекты обусловлены изменением гибридизации изотопа, а не расщеплением связи. По-видимому, наиболее известным примером вторичного изотопного эффекта в ферментативных реакциях является замещение водорода на дейтерий или тритий при С-1-атоме субстратов лизоцима (гл. 12, равд. Д). В ходе этой реакции образуется карбоний-ион, а гибридизация атома С-1 меняется от зр' к зр'. Для модельных реакций йя/йо = 1,14, что близко к величине 1,11 для ферментативной реакции 162, 63) ОР)Г г К Р К~ (2. 85) 3.
Иэотопные эффекты, обусловленные растворителем Изотопные эффекты, обусловленные растворителем, проявляются при сравнении скоростей реакций в Н,О и Р~О. Обычно эти эффекты связаны с переносом протона между электроотрицательными атомами, сопровождающим образование и разрыв связи между более тяжелыми атомами в таких реакциях, как Р, Р О О Н ГО Н,.О., О О СН,— С (2.86) О В:1Р Р СН,— С о — к ВЪН Н Изотопные эффекты, обусловленные растворителем, по своему происхождению отличаются от изотопных эффектов, сопровождающих расщепление связи С вЂ” Н, и их природа до конца не ясна. Перенос протона происходит гораздо быстрее, чем образование и разрыв связи, и в ходе реакции протон, вероятно, находится на дне потенциальной ямы.
Исчезновение нулевого энер- ХИМИЧЕСКИЙ КАТАЛИЗ 99 3. Стереохимип (651 Представление о том, что ферменты обладают специфичностью только к одному из двух оптически активных изомеров субстрата, не менее старо, чем сама стереохимия. Пастер, гениальный химин и биохимик, сообщил в 1858 г., что он обнаружил дрожжи, сбраживающие правовращающую винную кислоту и не способные сбраживать левовращающую. Ранние исследования протеаз показали, что гидролизуются производные только 1.-, но не О-аминокислот.
СО,Н С Нз)ч СН, СО.Н ! С НЗС в 1ЧН2 Н (2.87) ь- аланин о-аланин Соединение является оптически активным, если оно не может быть совмещено со своим зеркальным отображением, т. е. со своим энантиомером. Такое соединение поворачивает плоскость поляризации плоскополяризованного света. Чтобы проверить, совмещается ли данное соединение со своим зеркальным отображением, надо просто установить, обладает ли оно плоскостью или центром симметрии. Наличие подобной симметрии оз- гетического уровня (как это имеет место при переносе протона отатомауглерода, в котором сам разрыв связи С вЂ” Н протекает медленно) в этом случае не происходит.
Определенный вклад в экспериментально наблюдаемый изотопный эффект, обусловленный растворителем, могут вносить сольватация реагентов и вторичные изотопные эффекты, вызванные заменой в реагентах водорода на дейтерий. Рассматриваемые изотопные эффекты являются весьма ценным инструментом исследования простых химических реакций, хотя величины этих эффектов могут сильно варьировать. Например, установлено, что для реакций типа (2.86), катализируемых по механизму общего осндвного катализа, отношение йи/йо равно 2, тогда как для нуклеофильной атаки эфира оно близко к 1. Изотопные эффекты в ферментативных реакциях труднее интерпретировать, поскольку в молекуле белка слишком много протонов, которые способны обмениваться на атомы дейтерия 164].
Кроме того, при замене растворителя может слегка измениться структура белка. 1ОО глава з (2.88) Причина стереоспецифичности протеаз (ферментов, на которых были выполнены ранние стереохимические эксперименты) сразу же становится понятной прн анализе их кристаллической структуры (гл. 1 и 12). Производные Р-аминокислот отличаются от производных 1-аминокислот тем, что Н-атом и боковая цепь, присоединенные к хиральному атому углерода, поменялись в них местами. Связывание Р-производных невозможно из-за стерических затруднений при контактировании фермента и боковой цепи аминокислоты, место которой в Е-производных обычно занимает Н-атом. О !! хс1чН вЂ” С О ~' 11 С1Ч ~ н (2.89) начает, что данное соединение оптически неактивно, и наоборот.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
