Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 19
Текст из файла (страница 19)
3.2. График Ласиуиасра — Бэрка. .//5/ Рис. 3.3. График Эди — кофсти. Другой часто использующийся график — это график Эди— Хофсти [уравнение (3.29)] [6, 7]. Преобразование уравнений (3,!) и (3.2) приводит к выражению с = *т' „— Кмсй51. (3.29) ОСНОВНЫЕ УРАВНЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИЗНОИ КИНЕТИКИ 119 Г. Ингибирование Помимо необратимой инактивации ферментов при нагревании или действии химических реагентов, может происходить обратимое ингибирование в ходе нековалентного связывания ингибиторов. Различают четыре основных типа ингибирования.
1. Конкурентное ингибнрование Если ингибитор 1 связывается с активным центром фермента и препятствует связыванию субстрата 8 и наоборот, т. е. 1 и $ конкурируют за связывание с активным центром,то говорят, что 1 является конкурентным ингибитором.Для простого механизма Михаэлиса — Ментен [уравнение (3.4), Км=КЕ] следует рассматривать еще одну стадию: з км Ааа! Е ч-=-" Еа — а Е+ Р. (3.30) Е! Используя при выводе уравнения скорости соотношение ]е]а ]еа] +! е1] + ]е], получаем !е], !3]А м Вгах'7 ааааа ' (3.31) (3.32) График, построенный в координатах [и/[5]; О) (рис.
3,3), представляет собой прямую, отсекающую на оси ординат (при о/[8] = О) отрезок, равный ]т„ах. Тангенс угла наклона этой прямой равен — Км, а отрезок, отсекаемый ею на оси абсцисс, ]Таа а х! К м. График Лайнуивера — Бэрка имеет тот недостаток, что при высоких концентрациях субтрата экспериментальные точки попадают иа небольшой отрезок, в результате чего точкам, соответствующим низким концентрациям, придается слишком большой вес.
Достоинство же этого графика состоит в том, что он позволяет просто оценить значение О при данной концентрации субстрата [3]. График Эди — Хофсти лишен указанного выше недостатка, однако определить с его помощью значение скорости труднее, Считается, что этот график дает более точные результаты, поэтому для определения параметров Км и )т „исследователи предпочитают пользоваться именно им [8, 9]. ГЛАВА 3 120 Канкана ентное г/Х Бесконкнпе нт Неконкнрентно г/д7 Рис. ЗЛ.
Графики Эди — Хофстн (слвва) и Лайнуивера — Бэрка (справа) для различных типов ингибирования. Жирные прямые соответствуют реакциям в отсутствие ингибитора, тонкие — реакциям в присутствии ингибитора. Можно видеть, что Км увеличивается в (1+11]/Кг) раз. Это уравнение применимо ко всем механизмам, для которых справедливо уравнение Михэлиса — Ментен. Конкурентное ингибирование влияет только на параметр Км и не сказывается на )г',„, поскольку при бесконечно больших концентрациях субстрат вытесняет ингибитор из активного центра фермента. 2. Неконкурентное, бесконкурентное и смешанное ингибирование Когда 1 и Я присоединяются к ферменту одновременно, а не конкурируют за один и тот же центр связывания, наблюдается 121 ОснОВные уРАвнения Ферментятивнои кинетики ® Я Б Рис. 3,6, А.
Конкурентное ингибирование; ингибитор и субстрат конкурируют за один и тот же центр связывания. Например, индол, фенол и бензол связываются в гидрофобном кармане химотрипсииа и ингибируют гидролиз производных триптофана, тирозина и фенилаланина. Б. Неконкурентное ингибирование! ингибитар и субстрат одновременно связываются с ферментом. Примером такой реакции может служить ингибирование фруктово-1,6-дифосфатазы АМР. Этот тип ингибирования имеет много общего с действием мультисубстратных ферментов.
Примером бесконкурентного ингибирования односубстратного фермента, который встречается довольно редко, является ингибирование щелочной фосфатазы Е-фенилаланином 1чз!зозп Н. К., и!51!щап АЧ. Н., Я. Ыо!. Сйет., 241, 26!6 (1966)1. Этот фермент состоит из двух идентичных субъединиц, н фенилаланин предположительно связывается с одним центром, а субстрат — с другим. иная картина: 5, гтм еса! Е ц==н ЕЗ <з.зз> !,к, !.к! 5, дм а' Е1 ~=с Е61 Для частного случая механизма Михаэлиса — Ментен, когда константы диссоциации для высвобождения субстрата из комп- ГЛАВА 5 122 Д. Непродуктивное связывание Известны случаи, когда наряду с продуктивным связыванием происходит связывание субстрата с активным центром фермента таким образом, что образуется неактивный комплекс. Подобные случаи носят название непродуктивного связывания.
Ав ,Ез — э ЕР Е «5~, Ч ЕЗ. Влияние непродуктивного связывания на механизм Михаэлиса — Ментен проявляется в уменьшении обоих параметров, й„~ и Км. Параметр й„~ уменьшается из-за того, что при насышении продуктивно связывается только частьсубстрата. Км становится меньше К5, поскольку наличие дополнительных вариантов связывания должно приводить к более прочному свя.
зыванию. Решая уравнение (3.38) обычным способом, получаем [Е[О [3[ А2 «5+ [З[(1 + «5/К5) Из сопоставления уравнений (3.36) и уравнения Михазлиса— Ментен пол чаем у А,м = Аз/([+ кз/«5) и ~М ~5/(1 + «5РЪ 5)' Следует отметить, что (3,37) (3,38) Асм/Км = Ат/«5 !- (3.39) лексов Е[3 и ЕБ одинаковы (т. е. Км=К,'„), но комплекс ЕВ[ нереакционноспособен (т, е. й' = О), А„,/(1+ [Ц/К~) ВИ+ «м Это случай неконкурентного ингибирования: в присутствии ингибитора константа Км не изменяется, а й„~ уменьшается в (1+ (1]/К~) раз.
В более обшем случае константы диссоциации для высвобождения 3 из комплексов Е[8 и ЕЯ различаются. Это приводит к тому, что в присутствии ингибитора меняются оба параметра (Км и йьм), и такое ингибирование называют смешанным.,Ингибирование, при котором 1 связывается Е8 и не связывается Е, получило название бесконкурентного. ОснОВные уРАВнения ферментАтиВной кинетики 123 Другими словами, на отношение йьм/Км не влияет наличие дополнительного способа связывания, поскольку й„~ и Км изменяются симбатно.
Так, например, если непродуктивно связывающий центр связывает субстрат в 1000 раз прочнее, чем продуктивно связывающий, то Км будет в 1000 раз меньше КВ, однако, поскольку из тысячи молекул продуктивно связывается только одна, й„1 будет в 1000 раз меньше, чем /гз (строго говоря, в 1001 раз). Е. /г„,/К = /г2/К, Уравнение (3.39) для непродуктивного связывания носит довольно общий характер. Оно применимо не только к случаям непродуктивного связывания, но и к реакциям, в ходе которых образуются промежуточные соединения.
Например, если для катализируемого химотрипсином гидролиза эфиров [схема (3.19)], при котором происходит накопление ацилфермента, взять отношение выражений (3.21) и (3.22), мы получим равенство й. 1/Км = й2/КВ. Очевидно, это соотношение не выполняется для механизма Бриггса — Холдейна, когда фермент-субстратный комплекс не находится в термодинамическом равновесии со свободным ферментом и субстратами. Следует иметь в виду, что если имеется несколько фермент-содержащих промежуточных соединений, находящихся по отношению друг к другу в состоянии быстро устанавливающегося равновесия, как в схеме (3.16), Км может оказаться сложной функцией многих компонент.
В этом случае в параметр й„~/Км вносят вклад все фермент-содержащие соединения. Ж. Конкурирующие субстраты 1. Другая форма записи уравнения Михаэлиса — Ментен Ав г ° Е — ~- Е 'Л АА ' «ЕА — ~. (3.40) Скорости реакций можно получить с помощью обычных методов стационарной кинетики или из уравнения Михаэлиса — Ментен. Однако если нас интересует отношение скоростей, то можно Предположим, что за активный центр фермента конкурируют два субстрата: 124 ГЛАВА 3 воспользоваться следующим простым приемом. Подставив (3.24) в уравнение Михаэлиса — Ментен (3.1), получаем = (ь„,/км) [е! [81, (3.4!) где ]Е] — концентрация свободного фермента. Ценность этого уравнения состоит в том, что в него вместо ]Е]А входит ]Е].
Оно позволяет прямо получить ряд важных соотношений. 2. Специфичность ферментов по отношению к конкурирующим субстратам Если за фермент конкурируют два субстрата, А и В, то, поскольку а[А[/Ш=ах=(А ~/Км)А[В[ [А[ (3.42) и д [В[КН =аз=(Ь,.~/Км) [В[ [В! (3.43) оА/эв -(А м/Км)А [А[/(а,а4КМ)в [В! ! (3.44) Отсюда следует важный вывод: специфичность, т.
е. выбор ферментом только одного из двух конкурирующих субстратов, определяется отношением ймм/Км, а не параметром Км как таковым. Поскольку й,.~/Км не зависит от непродуктивного связывания или накопления промежуточных соединений, эти факторы не влияют на специфичность (гл. 11). 3. Обратимость: уравнение Холдейна [10! 1. Равновесие в растворе А~ Ар к~ч [р[/[~! ь~/ьг (3.45) (3.46) Фермент не может изменить константу равновесия для взаимопревращений свободных субстрата и фермента в растворе, Это означает, что величины й, ~/Км для прямой и обратной реакций связаны определенным соотношением. В частности, в равновесии, когда скорости образования Р и 5 равны, (3,44) дает (Асм/Км)з [В[[я[ (аса~нм)е [В[ [Р[ (3.47) ОСНОВНЫЕ УРАВНЕНИЯ фЕРМЕНТАТИВНОИ КИНЕТИКИ так что (3.48) Выведенное соотношение известно как уравнение Холдейна, которое этот ученый получил в 1930 г.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
