Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 23
Текст из файла (страница 23)
6. Здесь же рассмотрим ситуацию, когда одна из стадий протекает гораздо быстрее другой. При таких условиях времена релаксации для двух стадий существенно различаются и не налагаются друг на друга. !. Быстрой является первая стадия (предравновесие) А~ 1з1 Ае Е ч= ==е Е5 ч===е Е5' (4.45) Этот случай легко проанализировать, имея в виду два обстоятельства: а) должны существовать два времени релаксациив по числу стадий; б) поскольку скорости этих стадий существенно различаются, каждую из них можно рассматривать отдельно.
Первое время релаксации относится к стадии связывания, Оно задается уравнением, аналогичным уравнению (4.27): (4.46) Второе время релаксации относится кмедленной стадии. Она представляет собой обратимую реакцию, н по аналогии с уравнением (4.19) величина, обратная времени релаксации, представляет собой сумму констант скорости прямой и обратной реакций.
Однако эффективная константа скорости прямой реак. ции равна яе, умноженной на долю фермента, находящегося в форме ЕЗ, т. е. (4.47) ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 145 где Кз — — Е л/А, (4.48) 2. Быстрой является вторая стадия. Приведенная выше реакция может служить примером индуцируемого субстратом конформационного изменения фермента (где Е5' — просто другое конформационное состояние) или примером накопления промежуточного соединения в ходе реакции. Следующая реакция дает пример смещения равновесия между двумя конформационными состояниями фермента, вызванного связыванием суб.
страта только одной из этих форм: з,кз Е' ~~ Е ас==ь Еа А 1 быстра Такой механизм имеет место при связывании лигандов с химотрипсином; этот фермент находится в двух конформационных состояниях, но ароматические субстраты связывает только одна из форм, Можно показать (разд. 6), что Кз 1/"= + -(1.1+К ) (4.50) Рассматриваемую ситуацию можно отличить от случая, когда быстрой является первая стадия, поскольку !/Тз уменьшается с увеличением [5]. Это легко понять, проведя аналогию с необратимыми и обратимыми реакциями [уравнения (4.1) и (4.10)]. Ясно, что, когда концентрация 5 очень высока, реакция по существу необратима, поскольку форма Е' полностью переводится в форму Е5 н, следовательно, 1/т, стремится к йс Аналогичным образом, когда [5] -ы0, концентрация Е5 становится очень малой и 1/тз-ы й, + я ь Следовательно, время релаксации зависит от концентрации.
4. Параллельные реакции Ав,;Г А 'с' 0 (4,51) О параллельных реакциях говорят в тех случаях, когда соединение одновременно участвует в двух или болеереакциях. Такая ситуация часто встречается в ферментативных реакциях, протекающих с образованием активированного промежуточного соединения, способного реагировать с несколькими конкурирующими акцепторами: ГЛАВА Е ыв Кинетические уравнения для этого случая легко решаются путем интегрирования, однако весьма полезно получить их решения, исходя из интуитивных соображений, Очевидно, что уменьшение концентрации вещества А определяется константой скорости, являющейся суммой констант йо и йс, а скорость образования соединений В и С пропорциональна отношению соответствующей константы к суммеконстантйо и йс.
Поскольку скорости образования В и С зависят от концентрации А, оба эти соединения должны образовываться с константой скорости, равной константе скорости их исчезновения. Следовательно, [А! [А)охи [-(Ав+ Ас) «] (4.52) [В! о в (1 — ехр [-(Ав+ Ас) «]) Ав+ "с [С! + [! — ехР [ — (Ав+ Ас) «]). [А)о Ас (4.54) Как н для обратимых реакций [уравнение (4.!О)], время релаксации представляет собой сумму времен релаксаций для двух реакций. Примеры параллельных реакций приведены в гл. 7 (атака различными нуклеофилами ацилхимотрипсина, кинетика которой исследована в стационарных и предстационарных условиях).
5. Вывод уравнений для метода температурного скачка Рассмотрим в качестве иллюстрации связывание фермента с субстратом, протекающее в одну стадию: Ае Е+ 8 е:— —. Е8. (4.55) Предположим, что вследствие изменения температуры происходит смещение равновесия, так что [Е! [Е[ео+ е (4 56) [8! [8! + ю, (4.57) )ее + ех' (4.58) где ! Е] „„[$] ео и [Е5] „, — равновесные концентрации соответствующих соединений при новой температуре.
е! [Е8 !«е[«А1 ( [Е[еа + е) ( [8[ее + х) А ~ ( [Е8)еа + ех) = (4.59) ел! [Е[ео [8[ее «-! [88[ее+ А~ ( [Е[ео е+ [8)ее е + е х) — А ~ех. (4.60) Уравнение (4.60) можно упростить. Первые два члена в правой части взаимно уничтожаются, поскольку в равновесии они рав- ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 147 ны. Кроме того, так как реагенты сохраняются, е = з = — ез.
А поскольку концентрация (ЕЯ„постоянна, е[(ЕЯ]/Ог = = е[ез/й. Следовательно, (4.6!) — атее/<П й, ([Е] ее + [8] ее + евое) + й ,ее. Далее, если смешение равновесия невелико, членом второго порядка малости, е з, можно пренебречь, В таком случае уравнение (4.6!) удается проинтегрировать и найти время релаксации: 1/т й, ( [Е]+ [8]) + й (4.62) 6. Общее решение для двух последовательных обратимых реакций Рассмотрим две последовательные реакции: й1 йе А ч==~ в ~ с й й й (4.63) В этом случае необходимо решить систему линейных дифференциальных уравнений, что даст два времени релаксации: 1/т~ = Чй (р + д) 1/тй Чй(р — Ч) (4.64) (4.65) где р = й1 + й-1+ йе+ й-ь е = [ре — 4 (й|йе + й-~й-й + й~й-й)] /~.
(4.66) Эти основные уравнения могут быть использованы во многих случаях. Весьма полезно выразить константы скорости в виде сумм и произведений времен релаксации: (4.67) (4.68) 1/т~ +!/Те й! +й — ! +йе+й — ъ 1/тате ййй + й М вЂ” й + й~й и Эти уравнения легко решаются, если имеется концентрационная зависимость времени релаксации. Например, если реакционная последовательность представляет собой ряд превращений псевдопервого порядка: А~1 131 йй Е ~~ Е8 ч=-==:й Е8', й й Если равновесие смещается незначительно, то возвращение к равновесию всегда является процессом первого порядка, даже если концентрации реагентов близки.
ГЛАВА 4 1/т, = А', ( [Е] + [Б] ) + А В 1 А2((е]+[э]) ~~и -'~+ А /А 1 ([е] 1 [э]) ' (4.70) (4.71) Аналогичные выкладки можно провести и для последовательности Аз(з) Е ч----~ Е' ~~ ЕБ', (4.72) А ) А 2 где первая стадия является медленной. В этом случае мы получаем: (4.73) 1/т,=ь +А)([Е]+[5]), А, (/А,/А',) + [Е'] ) А,/А,'+(]Е']+[Э]) ' (4.74) Отметим два важных с практической точки зрения момента. Кинетические механизмы (4.69) и (4.72) можно различить, используя концентрационную зависимость 1/т,.
Для механизма (4.69) 1/тз при увеличении ]8] возрастает, а для механизма (4.72) — уменьшается. Однако в некоторых случаях провести такую дифференциацию не удается. Например, если для механизма (4.72) ]Е'] »]Е], то быстро образуется какое-то количество ЕЯ' с временем релаксации ть затем по мере превращения Е в Е' скорость образования ЕБ' замедлится и процесс будет характеризоваться временем релаксации ть Концентрационная зависимость тз будет слабой, поскольку при ]Е'] »]Е] К»й, (рис. 4.8).
В этой ситуации механизм (4.72) можно ошибочно принять за механизм (4.69), если в последнем количество образующегося Е8' мало, Кроме того, при /г з» /гз концентрационная зависимость 1/тз для механизма (4.69) слабая. В обоих случаях амплитуды изменений слишком малы, чтобы можно было точно измерить константы скорости. то й, в уравнениях (4.67) и (4.68) можно заменить на/г,']8].Кроме того, по аналогии с уравнением (4.62) для метода температурного скачка, константу й, при исследовании релаксации можно заменить на /г,([8]+ ]Е]). Если одно из времен релаксации много больше другого, уравнения (4.67) и (4.68) упрощаются.
Например, если первая стадия протекает гораздо быстрее, чем вторая, то в уравнении (4.67) членами 1/тз и (йз+ /г з) можно пренебречь. В этом случае тз определяется подстановкой (4.67) в (4.68). Для метода температурного скачка получаем ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 149 Более общий случай, с трудом поддающийся анализу,— зто двухстадийное связывание субстрата ферментом [схема (4.69) [ при условии, что константа диссоциации для первой стадии, Я) л)0 (бр ~Орпфлаакн], лгкау Рис.
4.8. График, показывающий невозможность дифференциации механизмов (4.69) и (4.72) с помощью уравнений (4.7!) и (4.74). Приведена зависимость константы скорости для связывания профлавина а-химотрипсином при рН 6,84 и 25оС от концентрации профлавина. Реакция протекает согласно следующем авнению: у ур Зпс Быстро Е Е' Е'РР. ее -1 РР [РегзсЫ А.
и., Пеяпепа То д, шо1. Вю1., 60, 279 (1971).] Константа скорости уменьшается с увеличением концентрации профлавина в соответствии с уравнением (4.19), однако это уменьшение невелико — манснмум на 19оа. й,/й',, велика. Если измерения проводятся только в той области, где й,/й', > ([Е[+ [3]), то уравнение (4.7!) сводится к виду ' 1(т = А + й[ Яй,) ( [Е] + [$] ). (4.75) ' Уравнение (4.71) было выведено в предположении, что й ~ ~ Ас.
Если Аз сравнима с А „уравнение (4.75) преобразуется к виду а',Аз !гтс А з+ + ( [Е]+ [8] ). — 1+ ~т ГЛАВА 4 Данное выражение имеет такой же вид, как и для случая простого одностадийного связывания субстрата ферментом !уравнение (4.62)], что может привести к ошибочным выводам. В этом случае расчет константы скорости связывания дает й',Щл,), т. е. величину, меньшую истинной константы скоро- l сти й,. Занижение значений некоторых констант скорости 2 у Гл.7+А' з~, лгйу Рис. 4.9. Связывание лизоцима с (г(-ацетилглюкозамином)з.
Температуру рас. твора, представляюшего собой смесь фермента (0,03 — 0,2 мМ) и лиганда (0,02 — 4,1 мМ), резко поднимали от 29 до 38'С (рН 6). Низкой концентрации субстрата соответствует линейная часть кривой; получающаяся отсюда кажушаяся константа скорости второго порядка для связывания равна 10т М-' с-'.
Однако измерения при более высоких концентрациях показывают, что кривая выходит на плато; это означает, что процесс протекает в две стадии. (табл. 4.3), несомненно, обусловлено этим обстоятельством. Измерения всегда следует проводить вплоть до высоких концентраций субстратов, когда скорость реакции выходит на предельный уровень, предсказываемый уравнением (4.7!) (рис. 4.9; см. также рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
