Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Проиллюстрируем это на примере рН-зависимости 1/Ен (а не Еи): Н (»»а + [»» ])/(~НА [»» ] +»'А»са) (61») Преобразование уравнения (5.11) к виду (6.8) дает »»»н (»»а/»НА +[»» ]/»нА)/(»Га»А /»нА+[»» ])' (5'12) Непосредственно из рассмотрения знаменателя уравнения (5.12) мы можем сказать, что график, построенный в координатах (рН; 1/А,н), даст кажущуюся константу ионизации К,рр, определяемую уравнением: Карр = Ка (» А ! НА).
(5 13) РН-ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 169 В. Влияние ионизация ионогенных групп ферментов на кинетику Несмотря на то что ферменты содержат множество ионизирующихся групп, графики зависимости скорости реакции от рН имеют форму, соответствующую однократной или двукратной ионизации. Связано это с тем, что единственной важной ионизирующейся группой является группа активного центра, непосредственно участвующая в катализе, либо группа, расположенная вне активного центра, но ответственная за сохранение активной конформации фермента.
Рассмотрим несколько простых примеров, начав с механизма Михаэлиса — Ментен. Сделаем ряд упрощающих допущений, как правило, выполняющихся в действительности. 1. Группы ведут себя как идеально титрующиеся кислоты и основания (в действительности обычно имеет место достаточно хорошее приближение). 2. Активна только одна ионная форма фермента (обычно это условие выполняется).
3. Все промежуточные соединения с точки зрения переноса протона находятся в равновесии, т. е. перенос протонов осуществляется быстрее химических реакций (обычно это условие выполняется; см. гл. 4), 4. Природа лимитирующей стадии не изменяется с рН (это допущение может не выполняться, что приводит к весьма инте. ресным последствиям).
1. Простая теория: механизм Михаэлиса — Меитен кз Аее! е ея Медлее ее ке11 НЕ ч==е- НЕЗ к', (5.14) Здесь Ке — константа ион из ации свободного фермента, КР5 — константа ионизация фермент-субстратного комплекса, з К' и КЗ вЂ” константы диссоциации НЕБ и ЕЗ соответственно. Эти четыре константы равновесия не могут изменяться независимо друг от друга, поскольку все превращения взаимосвязаны.
Если известны три из четырех констант, то четвертая опрв* гго ГЛАВА $ деляется из соотношения I к,к,=к„к,. (5.15) Уравнение (5.15) можно получить приравниванием произведений констант ионизации и констант диссоциации или просто из рассмотрения схемы (5.14), поскольку процесс НЕ5-э ЕБ-+.Е должен сопровождаться таким же изменением энергии, как и процесс НЕ5 — !- НЕ -!- Е.
Из уравнения (5.15) следует, что а) если КВ = Кез, то КВ= К' и связывание не зависит от рН; б) если КВАКВА, т. е, рК, при связывании изменяется, то Кз = Кз (Кв/Каз) (5. 16) и связывание по необходимости должно зависеть от рН. 2. рН-зависимость параметров 7г„„)г„!/Кьо Км и ]/Км [],2] Если выразить концентрацию ЕЯ через [Е]о и проделать необходимые алгебраические преобразования, можно получить выражение для зависимости о от рН: ьса! !И)ч (З! кз+(з! [1+[и']7кез)+ кз[н']/ка ' Зависимость й„! от рН получается из уравнения (5.17) при условии, что [5] )) Кз, т.
е. (5.17) (5.18) КВКез + [Н+1 Кзкиз7КВ к„+[н ] (5.19) Км также зависит отсостояния ионизациифермент-субстратного комплекса, Сравнение знаменателей уравнений (5.!8) и (5.8) показывает, что зависимость У ., или й„! от рН определяется константой ионизации фермент-субстратного комплекса Кез. Кажушееся значение Км при каждом конкретном значении рН можно найти преобразованием уравнения (5.17) к виду ур авн ения Михаэлис а — Ментен (3.1) .
РН.ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 171 рН-зависимость параметра всьг/Км получается из рН-зависимости о при низких значениях [5] [или из отношения уравнений (5.!5) и (5.19)]. Уравнение (5.17) можно упростить, положив [5] равным нулю и преобразовав его к виду (йсасГКЗ) КЕ ( сьс( М)Н= К 1 [Н+] (5.20) 3. Простое правило для идентификации компонента ферментативной реакции, определяющего характер рН-зависимости кинетических параметров Приведенные выше результаты являются следствием общего правила, состоящего в том, что «зависимость константы равновесия К или константы скорости й от рН для процесса Х вЂ” ь У определяется константами ионизации Х».
Применим это правило к схеме (5.14), имея в виду, что субстрат также может содержать способные к ионизации группы. а, рН-зависимость Лссг. Рассматривается процесс а се! Е8 — + ЕР. (5.21) рН-зависимость параметра Й„г определяется ионизацией фермент-субстратного комплекса. б. рН-зависимость Км. Рассматривается процесс км Е8 — ч Е+ 8. (5.22) рН-зависимость Км определяется ионнзацией фермент-субстрат- ного комплекса. в. РН-Зависимость )7КМО Рассматривается процесс гкм Е+ 8 — ч Е8.
(5.23) рН-Зависимость 1/Км определяется ионизацией свободного ') Может вызвать удивление тот факт, что использование 1/Ки вместо Км дает иное значение рК,. Математическая сторона этого вопроса ясна из анализа уравнений (5.11) — (5.!3). РН-Зависимость Км позволяет получить РК, дли Е, 8 и Е8, однако для разных графиков эти константы определяются различными способами.
Другой подход к анализу зависимости 1ЕКм от рН предложен Диксоном [1). й эс/Км (и о при[5] « Км) определяется ионизацией свободного фермента. ГЛАВА 6 фермента и свободного субстрата. г. рН-Зависимость льм/Км. Асм/Км Е+8 — ~ ЕР (5.24) рН-Зависимость ймм/Км определяется ионизацией свободного фермента и свободного субстрата. В. Модификации простой теории и отклонения от нее Для объяснения рН-зависимости параметров каталитического процесса в случае более сложных механизмов, чем механизм Михаэлиса — Ментен в его первоначальном виде, необходимо модифицировать рассмотренную выше в общих чертах простую теорию, 1. Модификации, обусловленные наличием дополнительных промежуточных соединений а.
Промежуточные соединения, образующиеся в ходе реакции [3] кз 66 Ав Е + 3 ~в ЕЗ вЂ” ь ЕА — ь ЕР. (5.25) Присутствие дополнительных промежуточных соединений не сказывается на рН-зависимости йсм/Км или 1/Км, поскольку эти параметры зависят только от свойств свободногофермента и свободного субстрата. рН-зависимость й„~ или !/Км и в этом случае позволяет получить рК, для свободного фермента и свободного субстрата.
Однако теперь рН-зависимостьй„1 и Км отражает изменение свойств как промежуточного соединения, так и фермеит-субстратного комплекса. Если ЕА в уравнении (5.25) представляет собой основное фермент-содержащее соединение, то рН-зависнмость й„~ и Км даст его рК.. Если же накапливаются и ЕБ, и ЕА, то мы получим значение рК., являющееся средневзвешенным значением между рК, для ЕЯ и ЕА [4]. б. Наличие непродуктивного связывания [5] В том случае, когда наряду с продуктивным происходит непродуктивное связывание субстрата, рН-зависимость йсм и Км может дать кажущееся значение рК.
для важной в каталитическом отношении группы активного центра, которое далеко от его действительного значения в продуктивном комплексе. Такая ри-ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 173 ка НБ кз)[ нея $ к, низ Я 11к ЕЕ ЕР Медаеаае. $к нз' (5.26) Здесь НЕБ и ЕЯ вЂ” продуктивные комплексы, К' и К вЂ” константы равновесия для процессов взаимопревращения между ними и непродуктивными комплексами НЕБ' и ЕЯ'. Решая уравнение скорости, получаем ~ее! Ае к (1+ [н'1/к,") + 1+ [н'1/к', ' к, (1+ [н'1/к,) (5.27) (5.28) к (1+ [н+1/к,) +1+ [н+1/к', Преобразовав уравнения (5.27) и (5.28) к виду (5.8), из знаменателя выражения получаем, что наблюдаемое значение РКЕ равно (1+ К) Ркеье=Рка 1я (1 1 КР) ' (5.29) По причинам, обсуждавшимся ранее, рН-зависимость йеа~/Км и 1/Км при наличии непродуктивного связывания не изменяется. ситуация имеет место в том случае, если соотношение между продуктивным и непродуктивным связыванием сказывается на ионизации этой группы.
Предположим, что активность ферментов зависит от состояния группы, которая при высоком значении рН находится в форме основания. Если, скажем, при низком рН продуктивное связывание субстрата осуществляется легче, чем при высоком, то происходящее при снижении рН (через рК. каталитической групцы) уменьшение скорости по мере протонирования этой группы будет частично компенсироваться увеличением непродуктивного связывания.
В результате кажущееся значение рК., определяющее рН-зависимость йеаь станет меньше, чем рК. для продуктивного комплекса. рН-Зависимость Км изменяется аналогичным образом. Проанализируем этот случай с привлечением математического аппарата. ГЛАВА 6 174 2. Отклонение от простых правил: механизм Бриггса — Холдейна и изменение природы лимитирующей стадии при изменении рН; кинетические рК» (4, 6 — 8] а! аз Е+ 3 и===» ЕЗ вЂ” » ЕР. а (5.30) Рассмотрим предельный случай, когда константа скорости стадии химических превращений субстрата больше константы Рнс.
6.3. Схема, объясняющая различие между истинным н «кинетическим» рК, в механизме Бриггса — Холдейна, характеризующемся изменением при. роды лимитирующей стадии с изменением рН. При низком рН й»и/Км уменьщается как [йз/(й-,/й,))К«/(К. + [Н+)). [Это выражение можно упростить, приняв во внимание, что Кз = й-~/й~ и при низком рН [Н+) >> К, (см, рисунок),] При высоком рН й»н/Км выходит на предел и становится равной й,— константе скорости второго порядка для связывания фермента с субстратом. диссоциации фермент-субстратного комплекса (механизм Бриггса — Холдейна), В этой ситуации параметр йс»~/Км равен й,— константе скорости связывания субстрата ферментом. Предположим снова, что каталитическая активность фермента зависит от состояния ионизации группы, находящейся в форме основания.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
