Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Например, скорости реакций с ГЛАВА 6 участием многих дегидрогеназ можно измерить по скорости появления МАРН, регистрируя поглощение света с А= 340 нм (е = 6,23 106М-'см-'), поскольку 1)А0 в этой области не поглощает. Иногда в таких исследованиях используют искусственные субстраты, например в реакциях с участием эстераз — п-нитрофениловые эфиры, так как и-нитрофенолят-ион имеет максимум поглощения при 1= 400 нм (6=1,8 10'М-'см-'). Чувствительность метода зависит от коэффициента экстинкции соединения; для соединения с а = 1О'М-'см-' предельное его количество, которое еще можно определить, составляет 0,6 имоль (имеется в виду обычный спектрофотометр, когда для измерений необходимо по крайней мере 0,6 мл раствора, а поглощенно должно поставлять 0,01).
Возможные иеточиики ошибок Чаще всего к ошибкам приводит невыполнение закона Ламберта — Вара. Такая ситуация возникает по ряду причин. 1. Концентрация хромофора настолько высока, что он агрегирует или образует мицеллы; это сопровождается изменением коэффициента поглощения. 2. При высоком фоновом поглощении поглощается так много света, что проходящий через монохроматор свет с другими длинами волн становится существенным (<по. бочный свет»). 3.
Ширина щели монохроматора слишком велика, и на образец попадает свет с длинами волн, лежащими вне полосы поглощения хромофора. 4. Раствор мутный и рассеивает свет. 2. Спектрофлуориметрия Некоторые соединения способны поглощать свет, а затем испускать его (но уже с большей длиной волны). Это явление называется флуоресценцией. Эффективность процесса характе. ризуется квантовым выходом д, который равен отношению числа испускаемых квантов к числу поглощаемых (д всегда меньше единицы).
К природным флуорофорам относится 6)АОН, погло. щающий свет с А = 340 нм, а испускающий — с Х = 460 нм, Основной флуорофор в белках — триптофан — поглощает в об. ласти 276 — 296 нм, а испускает свет с Х = 330 — 340 нм.
Слабо флуоресцирует в этой же области и тирозин, В основе многих синтетических субстратов эстераз, фосфатаз, сульфатаз и гликозидаз лежит 4-метилумбеллиферон — сильно флуоресцирующее производное фенола. Теоретически спектрофлуориметрия примерно в 100 раз чув. ствительнее спектрофотометрии. Флуоресценция измеряется под 193 ПРАКТИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА прямым углом к пучку падающего света. Изменение интенсивности возбуждающего света, скажем, иа 5А4 изменяет интенсивность флуоресценции на те же 57ю При спектрофотометрическом анализе измеряются небольшие изменения интенсивности прошедшего света, и здесь любые флуктуации в интенсивности падающего света усиливаются; изменение ее на 5$ эквивалентно изменению поглощения на 0,02 единицы.
Хотя интенсивность флуоресценции пропорциональна интенсивности возбуждающего света, невозможно до бесконечности уменьшать концентрацию флуоресцирующего соединения, компенсируя это уменьшение увеличением интенсивности возбуждающего света. Это связано с наличием рассеяния света — рэлеевского, при котором рассеянный свет имеет ту же длину волны, что и падающий, и рамановского, при котором длина волны рассеянного света иная; все это существенно уменьшает интенсивность падающего света.
Кроме того, при высокой интенсивности возбуждения исследуемое соелинение может подвергаться фотолизу. Некоторые свойства флуоресценции Флуоресценция наблюдается в том случае, когда фотон поглощается соединением (которое переходит в возбужденное состояние с временем жизни 1О нс), а затем испускается им, Однако молекула, находящаяся в возбужденном состоянии, может потерять свою энергию, столкнувшись с другой молекулой (например, с иодид-ионом) или передав энергию другой группе той же молекулы. В таких случаях говорят, что произошло тушение флуоресценции. Исследование тушения флуоресценции триптофана в составе белка при связывании субстра. тов является весьма ценным способом оценки степени связывания.
Интенсивность флуоресценции может не только уменьшаться, но и увеличиваться. Например, соединение, лишь слабо флуоресцирующее в водном растворе, зачастую интенсивно флуоресцирует при переносе в неполярную среду. Таким свойством обладают, например, красители толуидин- и нафталинсульфоновые кислоты — при связывании в гидрофобных карманах белков они начинают сильно флуоресцировать, Интересно, что, если эти красители связываются в молекуле белка рядом с триптофановым остатком, они могут возбуждаться светом, по. глощенным триптофаном, т.
е. светом с ). = 275 — 295 нм, в результате переноса энергии с триптофана на краситель. В воде триптофан и )ЧАВН флуоресцируют слабо, однако их флуоресценция усиливается, когда они находятся в неполярных областях молекулы белка. При возбуждении небольших молекул плоскополярпзован- ГЛАВА Э ным светом испускается неполяризованный свет, поскольку в растворе эти молекулы непрерывно вращаются, причем время вращательной релаксации значительно меньше времени жизни возбужденного состояния. Однако крупные молекулы вращаются медленно.
Согласно эмпирическому правилу, время вращательной релаксации в наносекундах приблизительно равно молекулярному весу в тысячах дальтон (химотрипсин с мол. весом 25 000 имеет время вращательной релаксации около 20 нс). Свет, испускаемый группами, которые являются частью молекулы белка или связаны с ней, будет частично плоскополяризованным, если они вращаются с такой же скоростью, как и вся молекула, Данное свойство можно использовать для изучения подвижности различных групп. Возможные источники ошибок Обычно источником ошибок является тушение флуоресценции. Оно может быть обусловлено попаданием в раствор посторонних примесей (например, иодида калия), но чаще всего имеет место концентрационное тушение, наблюдающееся атом случае, когда флуорофор или лиганд сильно поглощают свет и уменьшают интенсивность возбуждающего или испускаемого света. Так, если поглощение раствора равно А, то средняя интенсивность возбуждающего света в кювете будет [согласно уравнению (6.!)] равна (6.3) ~ = ~о Истинную интенсивность флуоресценции можно вычислить, исходя или из этого уравнения, или из более сложного, куда введены соответствующие поправки, а также с помощью стандартных кривых [1].
3. Автоматизированные спектрофотометрические и спектрофлуориметрические методы Наиболее удобно проводить спектроскопический анализ в том случае, когда продукты и реагенты имеют разные спектры и могут непосредственно регистрироваться; в этом случае достигается и наивысшая точность. Методы, основанные на окрашивании реакционной смеси с помощью специальных реагентов (например, окрашивание аминокислот нингидрином), можно автоматизировать, используя насос, смешивающий реагенты в требуемых соотношениях и пропускающий раствор через ячейку спектрофотометра или флуориметра (рис.
6.1). При этом иссле- пРАктичеСкАя кинетикл дования становятся менее трудоемкими, а получающиеся данные — значительно более воспроизводимыми и точными. Рис. 6.1. Автоматическое устройство для анализа аминокислот, образующихся в ходе реакции и окрашиваемых нингидрином. Перистальтический насос (П) смешивает нингидрин (Н) с гидразином (Г) и азотом. (В проточной трубке образуются вузырьки азота и разделяют жидкость на несмешивающиеся друг с другом последовательные участки.) Гидразин и нингидрин интенсивно перемешиваются в первом змеевике, образуя активный аналитический раствор.
Затем этот раствор смешивают и инкубируют с реакционной смесью (РС) в змеевине Зг при 95 'С в течение 20 мин., в результате чего смесь окрашивается. После охлаждения до 25 'С в змеевике Зз пузырьки азота удаляют через специальное устройство (Д), реакционную смесь пропускают через проточную ячейку спектрофотометра (СФ) и измеряют поглощение раствора.
Объем каждой порции смешиваемого раствора зависит от диаметра трубки. Тот же перистальтический насос откачивает раствор из ячейки прибора. Диаметр выводящей трубки существенно меньше суммы диаметров трубок, через которые все компоненты смеси постувают в ячейку, поэтому часть раствора и пузырьки азота с силой выбрасываются через устройство Д. [Регзй А. й., мепагб М.. Вюспегпйнгу 13, 1416 (1974); $.епагб Л, зойпзоп 8.!., Нушап м.'тЧ., Незз О. Р., Апа!.
В!осьеш., 11, 30 (1965), с изменениями.] 4. Использование сопряженных реакций Реакции, в ходе которых не образуются окрашенные или флуоресцирующие соединения, могут быть сопряжены с другими ферментативными реакциями, позволяющими получать такие соединения. Многие из этих реакций идут с образованием или расходованием )ч)АС!Н. Образование пирувата можно связать с превращением ]ч)АОН в ХАО с помощью лактатдегидрогеназы: и +МА н ~ *+МА~. (6.4) Образование же АТР можно связать с реакцией (6.4) с помощью пируваткиназы, как будет показано ниже. Для определения фосфофруктокиназы можно воспользоваться следующей ГЛАВА 6 совокупностью реакций: етк тк (РОР— фруктово-б-фосфат, РРР— фруктово-1,6-дифосфат, Руг — пируват, РЕР— фосфоенолпируват, РРК вЂ” фосфофруктокинанза, РК вЂ” пируваткиназа, !.РН вЂ” лактатдегидрогеназа).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
