Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 33
Текст из файла (страница 33)
при глубине превращения до бала) и построении такого графика, как график Эди — Хофсти [уравнение (3.29)) [3 — 5). Измерения скорости целесообразно проводить при следующих концентрациях субстрата: 8Км, 4Км, 2Км, Км, 0,5Км, 0,25Км, 0,125Км. 202 ГЛАВА 6 В. Определение констант диссоциации фермент-субстратных комплексов 1.
Кинетики Как указывалось в гл. 3, Км для ферментативных реакций не всегда равна константе диссоциации фермент-субстратного комплекса; она может быть меньше или больше этой величины в зависимости от того, происходит накопление промежуточных соединений или выполняется механизм Бриггса — Холдейна. Чтобы на основании результатов стационарной кинетики определить константы диссоциации фермент-субстратных комплексов, необходимо либо вводить какие-то допущения о механизме реакции, либо постараться получить дополнительные данные. Более ценную информацию дает предстационарная кинетика, поскольку в этом случае стадии химического превращения субстрата и стадии связывания часто можно разграничить.
Константы диссоциации для конкурентных ингибиторов легко определить из опь1тов по ингибированию, используя уравнение (3.32). Это уравнение выполняется независимо от того, является ли Км истинной константой диссоциации для субстрата. Сначала следует показать, что ингибирование является конкурентным; для этого определяют кажущуюся константу Км для субстрата при различнь1х концентрациях ингибитора, а затем из уравнения (3.32) рассчитывают К,. Значительные изменения в Км получены только при относительно высоких концентрациях ингибитора. 2, Равновесный диализ Этот метод позволяет прямо измерить концентрацию свободного и связанного с ферментом лиганда. Раствор фермента (и лиганда) отделяют от раствора лиганда при помощи полупроницаемой мембраны, через которую могут проходить только небольшие молекулы.
После установления равновесия, отобрав пробу из ячейки, содержащей белок, определяют сумму концентраций свободного и связанного лиганда; анализ пробы из другой ячейки дает концентрацию только свободного субстрата. Измерения можно проводить, используя лиганды, меченные радиоактивными изотопами, и ячейки объемом всего 20 мкл. Для анализа отбирают три образца по 5 мкл. Однако, поскольку для достижения равновесия даже при работе с самыми крупнопористыми мембранами требуется по крайней мере! — 2ч,этот метод непригоден для исследования нестабильных лигандов и фермен- йиулрвнмг4акмал левитана Рис.
6.3. Принцип равновесного диализа. Рис. 6.4. Микроячейки для равновесного диализа гЕпй!ппб Р, Т., НпЬегшап Я, А., Уоч!п Т. М., КогпЬегн А., Л, Ыо!. СЬев., 244, 3038 (!969!.! Полупроиицаемую мембрану помещают между двумя ячейками из плексигласа и скрепляют их. Изображенное устройство имеет два типа ячеек; меньшие по размеру половинки ячеек могут крепиться к любому торцу центрального блока.
Рис. 6.5. Микроячейки, изображенные ка рис. 6.4, смонтированные нв вра- щающемся барабане для помещения нх в термостат. ГЛАВА а тов. Для проведения быстрых измерений используется метод неравновесного диализа [6[, который основан на измерении скорости диффузии лиганда через мембрану из отсека, где он находится вместе с ферментом, в зависимости от концентрации. Связывание замедляет скорость диффузии. 3. Равновесная гель-фильтрация [71 Некоторые гели (например, сефадекс и биогель) имеют поры такого размера, что в них вполне могут поместиться небольшие лиганды, тогда как для белковых молекул эти поры слишком '„зо ч гб 2а гу р пу (и га съем, мл Рис б,б. Экспериментальные кривые, полученные при гель-фильтрации.
А. Туберкулиновый шприц объемом 1 мл содержал 109 мкМ раствор [ыС)валина (О) или 109 мкМ раствор р'С) валина и 4 мМ раствор АТР ( ° ). К этим растворам бмло добавлено 100 мкл 25 мкМ раствора валил-тРНК вЂ” синтетазы. Стехиометрия связывания аминокислоты составляла О,а и 1,1 соответственно. Обратите внимание, что пик и впадина разделены плато, расположенным на уровне базовой линии; зто означает, что опыт поставлен методически кор- ректно. Б. При связывании ферментом [умР] АТР и валина часть меченой АТР гндролизуется, давая [ззР)ортофосфат, который проходит через колонку.
быстрее, чем [Тззр) АТР; вто приводит к артефакту — появлению двойного пика. малы. Если заполнить хроматографическую колонку одним из таких гелейипропускать через нее раствор белка и лиганда, то белок будет проходить через колонку быстрее лиганда, поскольку последний проникает внутрь частиц геля и задерживается в них, тогда как белок перемещается между этими частицами. ПРАКТИЧЕСКАЯ КИИЕТИКА При проведении равновесной гель-фильтрации колонку уравновешивают раствором лигапда и наносят образец фермента, уравновешенный буферным раствором. Проходя через колонку, белок связывает лиганд и перемещает его с такой же скоростью, с какой движется сам. В результате положение пика, соответствующего выходу лиганда из колонки, совпадает с положением пика, отвечающего белку, тогда как впадина на кривой находится в области, обычно занимаемой небольшими молекулами.
Площадь под пиком равна площади впадины и соответствует количеству связанного лиганда. Достоинство этого метода состоит в том, что фермент находится в контакте с данной молекулой лиганда очень недолго, и, следовательно, метод может использоваться в тех случаях, когда фермент медленно гидролизует лиганд, Еще одним преимуществом данной методики является то, что имеющиеся гели позволяют разделять молекулы по размерам; это, например, дает возможность исследовать связывание тРНК (мол. вес 25000) аминоацил-тРНК вЂ” синтетазой (мол.
вес 100000) [8). Рассмотренный метод позволяет работать с микроколичествами препаратов. При связывании небольших лигандов удобно использовать туберкулиновый шприц объемом 1 мл, заполненный сефадексом О-25. В шприц вводят образец объемом 100 мкл и каждую каплю (объемом 35 — 40 мкл) собирают в пробирку. Для измерения объема капель их втягивают в шприц. Однако при разделении белка и крупного лиганда приходится использовать колонки значительно большего размера (типичный пример — колонка размером 0,7 Х 18 см, применяющаяся для разделения тРНК и тРНК вЂ” синтетазы). Возможные источники ошибок Для правильной постановки эксперимента необходимо, чтобы а) базовая линия оставалась постоянной; б) между пиком и впадиной находилось плато, расположенное на уровне базовой линии (это означает, что лиганд и белок существенно различаются по подвижности) и в) площадь пика была равна площади впадины.
(Поскольку очень трудно приготовить точно такой же раствор фермента и лигаида, как раствор лиганда в уравновешивающем буфере, целесообразно провести анализ аликвотгя раствора фермента перед его нанесением на колонку с тем, чтобы внести необходимые поправки в площадь впадины.) Причиной артефактов может быть задержка лиганда на ко. лонке, обусловленная, например, связыванием лиганда с гелем (как в случае АТР, АРР и АМР, которые связываются с сефадексом). Из-за более высокой подвижности фосфата и пирофосфата, образующихся при гидролизе (умР] АТР, появляются дополнительные пики и впадины (рис. 6.6), 206 ГЛАВА Е 4. Ультрацентрифугирование Связывание небольшого полимера с более крупным (например, тРНК с аминоацил-тРНК вЂ” синтетазой) нельзя исследовать методом равновесного диализа, а для равновесной гель-фильтрации требуются относительно большие объемы, В этом случае используют метод аналитического центрифугирования, позволяющий работать с объемами !00 — 200 мкл.
Ячейку центрифуги — Сидммзггтацил— Рис. 6.7. Седиментация смеси тРНК н вминоацил-тРНК вЂ” синтетазы. Комплекс фермента с тРНК осаждается быстрее свободной тРНК. Свободный фермент и его комплекс с тРНК осаждаются вместе, поскольку находятся в состоянии быстро устанавливвющегося равновесия.
заполняют раствором, содержащим смесь, скажем, тРНК и аминоацил-тРНК вЂ” синтетазы, и измеряют поглощение УФ-света связанной и свободной тРНК непосредственно в ходе седиментации. Комплекс фермента с тРНК, имеющий более высокий молекулярный вес, осаждается быстрее свободной тРНК, давая четкую границу поглощения, перемещающуюся по мере осаждения комплекса (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
