Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 34
Текст из файла (страница 34)
6.7) [9) '. ' Метод ультрацентрифугироввния может быть использован и для юучения связывания фермента с высокомолекулярным субстратом (например, для изучения связывания фосфорилазы гликогеипм: Чеботарева Н. А., Лисовская Н. П., Курганов Б. Ич Молекул. биология, !3, 228 — 236, !979),— Прим. ред. ПРАКТИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА 5. Фильтрование 1101 Многие белки, связанные с каким-либо медленно отщепляюшимся лигандом, адсорбируются на фильтрах из нитроцеллюлозы, тогда как свободный лиганд такими фильтрами не удерживается. В некоторых случаях это дает исследователю очень экономичный метод анализа связывания. С его помошью получено много ценных данных о присоединении нуклеиновых кислот к белкам. Отметим возможные источники ошибок при использовании фильтрования: часто связывание осушествляется менее чем на 1ООЭь; фильтры могут отличаться от партии к партии и насыщаться хри довольно низких концентрациях белка. 6.
Спектроскопические методы За исключением ЯМР, с помощью которого удается измерить концентрации свободного и связанного лиганда, спектроскопические методы обычно не позволяют прямо определить число связанных молекул лиганда. При связывании лиганда в спектре происходят изменения, позволяющие найти лишь долю связанного белка, и, не имея дополнительной информации, нельзя установить число присоединившихся молекул лиганда. Типичным примером такого рода является изменение в спектре флуоресценции белка или в спектре флуоресценции или поглощения лиганда, вызываемое присоединением лиганда к ферменту.
Обычно в таких опытах добавляют возрастающие количества лиганда к относительно разбавленному раствору белка и строят график зависимости изменения какого-либо параметра спектра от количества добавленного лиганда. Если связываемый лиганд не является хромофором, то исследуют конкурентное ингибирование процесса присоединения лигандов-хромофоров.
7. Титрование Если константа диссоциации комплекса достаточно мала, можно определить число эквивалентов лиганда, которое вызывает максимальное изменение в спектре; это максимальное изменение имеет место в том случае, когда заняты все центры связывания. Например, к раствору белка, концентрация которого по крайней мере в 1О раз больше константы диссоциации, добавляются возрастающие количества субстрата. Для установления стехиометрии строят график, представленный па рис.
6.8. Другой метод титрования предложен Джобом [11]. глава в п,пу ч ппг п,П( п,пп Г. Графическое представление данных по связыванию 1. Наличие одного центра связывания в молекуле фермента Связывание лиганда с одним центром молекулы белка опи- сывается следующими уравнениями: кз ЕЕ ~~ Е+ 1., Кз = (е) 1Ц((еЦ, (6.14) (6.16) (1нР)/(мегнь) Рис. 6.8.
Спектрофотометрическое титрование метгсмоглобнна (Ме(Н5) инозитолгексафосфатом (1НР). При 5!2 и 649 нм поглощение комплекса увеличивается, а при 640, 618, 588 и 559 нм остается постоянным. Концентрация метгемоглобина в расчете на тетрамср (20 мкМ) примерно в 14 раз превышает константу диссоциацин (1,4 мкМ) этого комплекса. Точка пересечения касательной к начальному участку кривой с плато дает стехиометрию связывания (в данном случае 1) Заметим, что этот простой метод нельзя использовать, если начальная концентрация белка не очень сильно превышает константу диссоциация, поскольку предполагается, что весь лигаид связы. вается белком сразу после добавления.
ПРАКТИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА где [Е] и [Е] — концентрации свободного фермента и лиганда соответственно. Вводя полную концентрацию фермента [Е]е, получаем !Е1-1 [Е1е [ь]/([ь]+ Аз). (6.16) Уравнение (6.!6) аналогично уравнению Михаэлиса — Ментен и может использоваться аналогичным образом. Удобным способом графического представления данных является построение графика, аналогичного графику Эди: [Е1.] = [Е]с Кз ([ЕЬ]/!Ь]) (6.17) Построение графика в координатах ([ЕЦ/[1]; [Е1]) дает значение /(з.
Уравнение (6.17) нельзя использовать для непосредственного анализа спектроскопических данных, поскольку концентрация Е1 неизвестна. Однако, поскольку эта величина обычно прямо пропорциональна изменению определенного параметра спектра, можно написать, что АРвгах Кз (АР/[~"!)' (6.18) где ЛР— изменение этого параметра при добавлении лиганда к раствору белка до конечной концентрации [Ц .
График в координатах (ЛР/[Ц; ЛР) дает Кз и ЛРюах — изменение параметра при переходе всего белка в связанное состояние'. 2. Наличие нескольких центров связывания а. Идентичные центры Если молекула белка имеет п идентичных, не взаимодействуюгцих друг с другом центров, то уравнение (6.17) можно преобразовать к виду ч = и — Кз (ч/[Ь]), (6.19) где и — число молей лиганда, связанных с одним молем белка. Из графика, построенного в координатах (т/[Ц; зг) (график Скэтчарда), можно найти стехиометрию (и) и константу Кз.
' Особый случай спекгрофлуориметрического титрования при сопостави. мых коннентрапиях фермента н лиганда, когда величины [Е]а и ЬР .„неизвестны, проанализирован в следующих работах: Курганов Б. И., Гуре. вич В. М., Сугробова Н. П., Яковлев В. А., Молекул. биология, 6, 698 — 704, 1972; Курганов Б. И., Сугробова Н.
П., Яковлев В. А., ЕЕВЬ Ьеиегз, 19, 308 — 310, 1972. — Прим. ред. 210 ГЛАВА е Нендентичные центры Если в молекуле белка имеется два типа центров, один— сильно связывающий, а другой — слабо, то график Скэтчарда будет состоять из двух частей, относящихся к связыванию с разными центрами. Определить значения Ке из таких графиков можно только в том случае, если эти константы различаются по крайней мере в 10 раз.
Приложение: сцинтилляторы !. ВВОТ. Хотя этот смешивающийся с водой сцинтиллятор уступает по емкости раствору Брэя [12], его проще приготовить и он не портится при стоянии на свету. В нем может присутствовать до 1$ воды. Два литра сцинтиллятора содержат 9 г ВВОТ (2,5-бис- [5'-трет-бутилбеизоксазолил- (2') [ -тиофена), 1,51 г толуола и 0,51 г метоксиэтанола. 2. РРО(РОРОР. Фильтры из нитроцеллюлозы можно прямо погружать в этот не смешивающийся с водой сцинтиллятор.
Состав сцинтиллятора; 2,5 л толуола, 12,5 г РРО (2,5-дифенилоксазола) и 0,75 г РОРОР (1,4-бис-[2(5-фенилоксазолил)[бензола). СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1, Еагелаегу М., Сгопоал Е., УУ!у!ег К., РЕВ5 1.е!!е., 18, 199 (1971). 2. Сияаепаегт Е А., РЫЬ Мек., 2„538 (1926). 3. УУУтто У, А., Аыте С. Е., В)осьев. У., 141, 913 (1974). 4, Уела!луе У!. )7., Н!еталп С., У. Ав. сьев. 5ос., 77, 5432 (1955). 5. Согп!еа-Вотг(еп А., В!осьев. У., 149, 305 (!975). 6. Со!от!с)г В. Р., уготаса Р.
С., У. Ьго!. СЬев., 244, 774 (1969). 7. Нетте! У. Р., Огеуег аг. У., 81осЫв. Ыорьуе. Ас1е, 63, 530 (!962) 8 Пгагегеоп К. М., С!агае В. У., КаУоиееу Р., Коп!уеьегу 5Г„Н., 3. Ыо!. СЬев., 248, 181 (1973). 9. Кгаиег С., Р!пуоигУ А., ВоеИте О., Кгеспег О., Ре!егг Р., Мааса С., Еш. А В!осьев., 55, 5!7 (1975). 10. Уагие М.„Вегу Р., Апе)уе. Ввсьев., 35, 450 (Ь970). !1 Уоь Р. Аппих СЫгп.
(5ег. 10), 9, 113 (1928). !2. Вгау С. А., Апе)у1. В!осьев., 1, 279 (1960). Глава ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КИНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ Механизм ферментативной реакции можно считать полно стью установленным, если охарактеризованы все промежуточные соединения, комплексы и конформационные состояния фермента и определены константы скорости их взаимопревращений. Таким образом, задача исследователя состоит в установлении числа и последовательности промежуточных соединений и процессов, выяснении их природы (т.е. в установлении, образуются ли промежуточные соединения с ковалеитными связями или имеют место конформационные изменения), в измерении констант скорости и (исходя из анализа их рН-зависимости) в определении степени участия в катализе кислых и оснбвных групп.
Исследователь должен установить химическую природу промежуточных соединений, выяснить, в ходе каких превращений они образуются и распадаются, и определить тип катализа. Все эти результаты вместе с данными рентгеноструктурного анализа и теоретическими расчетами позволят полностью описать механизм данной реакции. Рассмотрим ряд методов обнаружения промежуточных соединений и описания путей реакции на примере процессов, катализируемых некоторыми хорошо изученными ферментами.
А. Возможности нредстационарной и стационарной кинетики Часто можно услышать, что кинетика не в состоянии доказать правильность предложенного механизма, но зато всегда может исключить альтернативные механизмы. Это утверждение, несомненно, справедливо для стационарной кинетики, когда измеряются только скорости появления продуктов или исчезновения реагентов, но оно не распространяется на предстационарную кинетику. Если промежуточные соединения можно регистрировать н, таким образом, определить скорость их образования и исчезновения, исследователь в состоянии доказать адекватность данного механизма. В этом заключается главная сила предстационарной кинетики; фермент берется в количествах„ сравнимых ГЛАВА т 212 с количеством субстрата, и исследуютсясобытия, происходящие на самом ферменте.
Конечно, и в этом случае некоторые промежуточные соединения могут остаться неидентифицированными — либо из-за того, чтоонине накапливаются, либо из-за того, что не дают вклад в изменение спектров или просто имеют слишком малые времена превращения, чтобы их можно было зарегистрировать. И тем не менее общий ход реакции можно проследить достаточно строго с помощью предстационарной кинетики. Основная слабость стационарной кинетики состоит в том, что получаемые данные всегда являются неоднозначными. Стационарная кинетика не дает прямой информации относительно числа промежуточных соединений и поэтому всегда оперирует минимальным числом этих соединений.
Это не означает, что предстационарная кинетика должна вытеснить стационарную; скорее следует использовать сочетание этих двух подходов. Стационарная кинетика становится значительно более мощным инструментом, если с помощью предстационарной кинетики получена информация о промежуточных соединениях. Предстационарная кинетика обладает рядом преимуществ с практической точки зрения. Она имеет делосочень простыми по сути процессами; например, с ее помощью определяют стехиометрию процесса, в ходе которого происходит «всплеск> концентрации продукта, находят константы скорости переноса связанных с ферментом промежуточных соединений на второй субстрат или исследуют индуцируемые лигандами конформационные изменения в белках.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
