Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Кроме того, характеристики процессов первого порядка (которые обычно изучают) не зависят от концентрации фермента в отличие от констант скорости, измеряемых в стационарной кинетике. Для исследования быстрых реакций требуются очень высокие концентрации ферментов, но их значения близки к концентрациям 1п ч1чо. Более того, аналогичные концентрации обычно используются при прямом определении физического состояния белка, что позволяетполучать, например, данные об агрегации в условиях, при которых протекает реакция. Данные предстационарной кинетики основаны на прямых измерениях, а прямые данные всегда предпочтительнее косвенных, особенно если учесть неопределенности, возникающие обычно при интерпретации данных стационарной кинетики (равд.
Б.4). 1. Выявление промежуточных соединений: что считать доказательством? Основная часть изложенного ниже материала посвящена вопросам определения путей превращения субстратов в ходе ферментативных реакций. Обычно прежде всего нужно обнару- КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 2!3 жить промежуточные соединения, поскольку это является доводом в пользу существования данного пути.
Мы будем считать, что образование промежуточного соединения в ходе реакции доказано, если выполняются следующие условия: а. Промежуточное соединение выделено и охарактеризовано. б. Промежуточное соединение образуется достаточно быстро, чтобы находиться на пути превращения. в. Промежуточное соединение реагирует достаточно быстро, чтобы находиться на пути превращения.
Чтобы выяснить, выполняются ли эти условия, необходимо на какой-то стадии исследований прибегнуть к предстационарной кинетике с тем, чтобы измеритьконстанты скорости образования и исчезновения промежуточного соединения. Однако просто провести такие измерения недостаточно — нужно показать, что полученные константы согласуются с активностью фермента в стационарных условиях. Следовательно, весьма полезно и даже необходимо использовать сочетание этих двух подходов. Следует помнить, что выделенное промежуточное соединение может представлять собой продукт превращения другого промежуточного соединения и на самом деле не образовываться в ходе реакции.
Вот почему нужно, чтобы выполнялись условия б и в. И наоборот, может оказаться, что выделено само промежуточное соединение, но при выполнении экспериментальных процедур фермент переходит в другую, менее активную коиформацию. В этом случае условия б и в не будут выполняться, несмотря на то что природа химического соединения не изменилась. Б. Химотрипсин: выявление промежуточных соединений с помощью метода остановленной струи, данных стационарной кинетики и определения соотношения между продуктами Механизм гидролиза амидов и эфиров, катализируемого этой типичной сериновой протеазой, включает образование на начальной стадии комплекса Михаэлиса с последующим ацилированием бег-195 и образованием ацилфермента (гл.
1). Многие кинетические исследования ферментов были направлены на выявление ацилфермента. Полученные результаты хорошо демонстрируют возможности предстационарной и стационарной кинетини. Ацилфермент накапливается при гидролизе активированных или специфических эфирных субстратов (йг ) йз), так что выявить его относительно просто. В случае физиологических 2!4 ГЛАВА У пепетидов накопления ацилфермента не происходит (йх ( Й5) и его выявление затруднено. хз А2 Аз Е+ ИСΠ— Х ~~ ИСΠ— Х.Š— ~ ИСΠ— Š— ~- ЦСО5Н + Е (7.1) + ХН 1. Выявление ацилфермеита, образующегося при гидролизе эфиров, с помощью данных предстациоиариой кинетики а. Исследование начального всплеска концентрации продукта реакции В 1954 г.
Хартли и Килби при исследовании реакции между химотрипсином, взятом в количестве, сравнимом с количеством субстрата, и избытком п-нитрофенилацетата или п-нитрофенилэтилкарбоната 11), обнаружили, что экстраполяция количества высвобождаюшегося п-нитрофенола к нулевому моменту времени дает не нулевое количество этого соединения, а указывает на наличие всплеска, амплитуда которого равна концентрации фермента (рис. 4.10). Они постулировали, что сначала эфир быстро ацилирует фермент в соотношении 1: 1, а затем в ходе последуюшего превращения субстрата идет относительно медленный гидролиз ацилфермента — стадия, являющаяся лимитируюшей.
Впоследствии это предположение было подтверждено в ходе исследований с применением метода остановленной струи. Позже аналогичные эксперименты были проведены и с многими другими ферментами. Однако наличие всплеска может быть обусловлено не накоплением промежуточных соединений, а причинами иной природы, что всегда следует иметь в виду. Ниже рассмотрено несколько примеров такого рода. а. При связывании с первым молем субстрата фермент переходит в менее активное конформационное состояние. б. Лимитирующей стадией является высвобождение продукта. в.
Имеет место сильное ингибирование продуктом. Исключить пп. а и б довольно сложно. Это удалось сделать в случае химотрипсина в ходе следуюших исследований с применением метода остановленной струи. б. Метод остановленной струи Д Хромофор в уходящей группе [2 — 4). Первые исследования, в которых использовался нитрофенилацетат, получили кинетичнскни методы и мвхлнизм двиствия еирминтов 215 дальнейшее развитие после того, как удалось синтезировать и-нитрофениловые эфиры специфических аминокислот, например Лззт Рис.
7.1. Метод вытеснения профлавина. Растворы химотрипсина (1О мкМ), нрофлавина (50 мкМ) и АсРЬеОИе (2 мМ) смешивали при рН = 6 и 25'С в приставке к спектрофотометру, прелназначенной для проведения исследований методом остановленной струи. Связывание субстрата протекало слишком быстро, чтобы его можно было зарегистрировать. Быстрое зкспоненциальное уменьшение поглошения обусловлено вытеснением профлавина из фермента при образовании ацилфермента.
Медленное увеличение поглощения отражает исчерпание субстрата и последующее уменьшение стационарной концен- трации ацилфермента [4). ацетил-).-фенилаланина, ацетил-1-тирозина и ацетил-).-триптофана. Скорость ацилирования фермента определяют по скорости появления нитрофенола или нитрофенолят-иона, полоса поглощения которого не совпадает с полосой поглощения исходного эфира. О )! С СН,СН х г НОз )ь)Н ! С=О Н,С л-1)игнрофениловагй эфир ит(атил-й- фенилаланина При смешивании эфира с ферментом сначала наблюдается быстрый экспоненциальный рост поглощения, а затем поглощение увеличивается линейно и отражает постепенное накопление ГЛАВА 1 нитрофенола. Константу скорости ацилирования и константу диссоциации фермент-субстратного комплекса можно рассчитать из концентрационной зависимости константы скорости экспоненциальной фазы [уравнение (4.44) ].
Константа скорости для линейного участка дает скорость деацилирования. К сожалению, нитрофениловые эфиры часто настолько реакционноспособны, что скорость ацилирования слишком высока, чтобы можно было использовать метод остановленной струи. 2, Хромофор в ацильной группе [4, б]. Поглощение фурилакрилоиловой группы зависит от полярности окружающей среды, а также от природы соединения, к которому эта группа присоединена. Связывание этилового эфира фурилакрилоил-Е-тирозина с химотрипсином сопровождается небольшим изменением в спектре его поглощения; образование ацилфермента и последующий гидролиз также приводят к спектральным изменениям. Из соответствующих экспериментов можно определить константы скорости ацилирования и деацилирования н константу диссоциации комплекса Михаэлиса. 9~ Н СН,СН ОСН,СН~ г Нн сн=сн О~ Зтиловый ггрир фурилаирилвил-~: мирегипа При смешивании этилового эфира фурилакрилоил-) -тирозина с ферментом на первом этапе происходит изменение поглощения раствора, обусловленное образованием комплекса Михаэлиса.
Константа скорости этого процесса лежит вне временной шкалы метода остановленной струи, однако данные по изменению поглощения можно использовать для расчета константы диссоциации. По мере накопления ацилфермента наблюдается экспоненциальный рост поглощения. Дальнейшие изменения в спектре фурилакрилоиловой группы связано с постепенным гидролизом этого эфира до свободной кислоты. д. Хромофор в обратимо связывающемсл ингибигоре [6, 7]. Спектр поглощения красителя профлавина очень сильно зависит от полярности растворителя. Профлавин является конкурентным ингибитором химотрипсииа, трипсина и тромбина; его связыва- КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ х17 ние сопровождается значительным увеличением поглощения при 465 нм (Ле 2 1О' М-' см-') (рис.
7.1). Н21ч Н (ЧН, Профлавин (З,б-гуиаминоакри1ин) При смешивании эфира (например, этилового эфира ацетил(.-фенилаланина) с химотрипсином и профлавином происходит следующее. Связывание субстрата с ферментом сопровождается быстрым вытеснением некоторого количества профлавина из активного центра, что приводит к уменьшениюАЫА. Когдаобразуется ацилфермент, равновесие между эфиром и профлавином при их связывании ферментом смещается, приводя к полному вытеснению профлавина. Поглощение остается постоянным до тех пор, пока не израсходуется весь эфир и не исчезнет ацилфермент. Зная количество вытесненного на первом этапе профлавина, можно рассчитать константу диссоциапии ферментсубстратного комплекса, а из второй, экспоненциальной фазы получить константу скорости ацилирования.
Метод вытеснения профлавина значительно более удобен, чем использование соединений, содержащих фурилакрилоиловую группу, поскольку нет необходимости синтезировать специальные субстраты; при работе со всеми субстратами можно использовать одно легкодоступное соединение. Вообще говоря, модифицированными субстратами лучше не пользоваться совсем, поскольку к трудностям, связанным с химическим синтезом, добавляются сомнения, правильно ли эти соединения идентифицированы.
4, Деацилирование. Отдельные неспецифические ацилферменты можно синтезировать и хранить их при низком рН 18— 11). При переходе к высоким рН ацилферменты деацилируются со скоростью, ожидаемой исходя из данных по стационарной кинетике. Этот подход был использован для изучения свойств специфических ацилферментов. При инкубации производных ацил-(,-триптофана в среде с рН 3 — 4 происходит накопление ацилфермента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
