Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 38
Текст из файла (страница 38)
) Акцентор 2 М трвс." рн З,2. «) Срецнее вхк несков«кнх фосфоеннаетов. 5'АМР Пирофосфат 3'АМР АТРАр бАТР НОТР 17ОР 5'с)МР 1 1 0,9 0,5 1,05 1,05 1,05 1,0 0,85 1,42 1,41 1,38 1,37 1,37 1,40 1,40 1,40 1 2 б) '1 е). в) 1,05 0,7 0,9 0,7 0,8 0,9 0,8 1,0 КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 2, Кислая фосфатаза Реакция, катализируемая кислой фосфатазой,— зто простой пример реакции с накоплением промежуточного фосфорилфермента, распад которого является лимитирующей стадией. Широкий круг эфиров гидролизуется кислой фосфатазой с одинаковым значением )' „(табл.
7.8) [35], причем соотношение Таблица 7.8 ггм н Р„ „ длэ катализнруемого кислой фосфатазой предстательной железы гндролнза эфиров фосфорной кислоты при рн б и 31'С (33) Эфиры фосфорной кислоты км ыМ гмин (относительнан) р-Глицерофосфзт 2' АМР Ацетилфосфат 3' АМР л-Нитрофеннлфосфат 1,1 0,28 0,17 0,068 0,034 Таблица 7.2 Соотношение между продуктами каталнзируемого кислой фосфатазой предстательной железы гидролиза эфиров фосфорной кислоты (36( Трансфосфорилироааниел'инролиэ Эфир фосфорной кислоты Акцеитор— этанол Акцентор- этанолаыин и-Нитрофеннлфосфат феннлфосфат 3' 1(МР 3' АМР 6-Глнцерофосфат 0,23 0,26 0,23 0,30 0,28 0,044 0,044 0,046 0,041 между продуктами остается постоянным (табл.
7.9); исследование методом остановленной струи с использованием а-ннтрофе. нилфосфата показывает, что во время всплеска высвобождается один моль гг-нитрофенолята на субъединицу фермента; фермент ковалентно модифицируется диизопропилфосфатом (36]. Быстро Мелленао Š— ОН+ ЯОРОЗН в=в Š— ОН.ЦОРОЗН вЂ” -о Š— ОРОЗН ЦОН вЂ” Š— ОН+ НРО;, (7 д) ГЛАВА У 230 3. р-Галактозидаза: сохранение конфигурации предполагаемого промежуточного соединения Алкоголиз й-Р-галактозидов й-галактозидазой происходит с сохранением конфигурации у атома С-1 137, 38]. ОН СН,ОН К кон НО ОК' (7.10) ОН НО Тем самым из этого процесса исключаются простые реакции бимолекулярного замещения (8в2), которые часто встречаются в органической химии, поскольку известно, что они всегда идут с обпащением конфигурации [39]. Х В С Х Х вЂ” С ВКХ С С (7.11) Сохранение конфигурации наблюдается всегда, когда имеют место два последовательных обращения у данного углеродного атома или если образуется промежуточный карбоний-ион, который может быть атакован нуклеофилом только с одной стороны.
Следовательно, сохранение конфигурации связано с наличием многостадийной реакции, в ходе которой образуется промежуточное соединение. Согласно этому критерию, реакция с участием лизоцима также идет с образованием промежуточного соединения [40, 41]. Данные, полученные при исследовании соотношения между продуктами при гидролизе р-галактозидов, свидетельствуют в пользу образования в ходе этой реакции промежуточного соединения (табл.
7.10). Из таблицы видно, что соотношение между водой и метанолом остается постоянным [42, 43]. Лимитирующей стадией в случае слабоактивированных субстратов является образование промежуточного соединения, поскольку У „ — величина переменная, а в случае сильноактивированных динитросоединений лимитирующей стадией становится гндролиз этого промежуточного соединения, так как скорость остается КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ Таблица 7.70 Соотноглеиие между продуктамн каталнзнруемого Р-галактозидазов гидролнза Р-галактозндов н относительные значении !г „ прн 25 'С и ри 7,0 — 7,5 (42 — 44) Мстааолиз/Гидролиз, м ) азад )стааситл Лимитиртюшаа стадиа б Галаитазид Легалактозн- дироваиие То же > 2,4-дииитрофеиил 1,3 постоянной.
С таким выводом согласуются данные о том, что скорость исчезновения 2,4-динитро- и 3,5-динитропроизводных возрастает при добавлении метанола, но не менее реакционно- способных субстратов (см. рис. 7.2 и 7.3). Возможный механизм этой реакции включает образование на начальном этапе карбоний-иона )44, 45). Г. Аминоацил-ТРНК вЂ” синтетазы: обнаружение промежуточных соединений методами «замороженной» струи, изотопного обмена и с помощью стационарной кинетики 1. Механизм реакции Эта группа ферментов катализирует образование аминоацил- тРНК из свободной аминокислоты (АА) и АТР. В отсутствие тРНК данные ферменты облегчают (за несколькими исключениями) атаку аминокислот нуклеофилами и АТР пирофосфатом )46 — 49). Активация осуществляется путем образования прочного комплекса с аминоациладенилатом, смешанным ангидрн- 3,5-дииитрофеиил 2,5-дииитрофеиил 2-иитрофеиил 3-иитрофеиил 3-хлорфеиил 4-иитрофеиил Фенил 4-метоксифеинл 4-хлорфеиил 4-бромфекил Метил 1,99 1,94 2,14 2,13 2,02 1,! 1,1 1,0 0,9 0,5 0,2 0,1 0,1 0,02 0,02 0,00 Гвлактозидироваиие То же > > > ГЛАВА т 232 О О Е Нз)ЧСН(И)СОв О-Р— Π— Р— 0 — Р— Π— СН !) ОА О О 0 в он он Пирвфаафат 1~ о 77 Е.Н,)ЧСН(И) С вЂ” Π— Р— ОСН, 1 "'О' 7)яклвафив ОН ОН О,Р— Π— Роз (7.13) Активацию атаки пирофосфатом исследуют с помощью обмена РРче АТР, для чего инкубируют фермент, аминокислоту иАТР с пирофосфатом, меченным "Р.
При этом в результате непрепрывного циклического формирования комплекса Е.АА АМР образуется р,у-меченый АТР. Механизм образования комплекса представлен на схеме (7.13). Атака меченого пирофосфата приводит к обращению реакции и образованию меченого АТР. Этот процесс многократно повторяется до тех пор, пока изотопная метка не распределится равномерно по всем реагентам. Ацилирование тРНК осуществляется в ходе атаки карбонильной группы карбоксилом рибозы концевого аденозина тРНК !схемы (7.!3) и (7.14)]. Е.Нв)чСН(Н)С - АМР ттн» Н,)ЧСН(р)С~ О ОН Е, АМР А О (ГРЕК! (7.14) Не вызывает сомнений, что фермент. содержащий аминоациладенилат образуется в отсутствие тРНК. Его можно выделить хроматографически, а свободный аминоациладенилат получить осаждением фермента кислотой [50, 5!]. Более того, этот выде- дом аминокислоты и АМР.
(Химическая сторона процесса активации обсуждается в гл. 2, равд. Г.2.в) Е АА+ АТР + тРНК вЂ” в АА.тРНК+ АМР+ РР (7.12) КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 233 ленный комплекс будет переносить свою аминокислоту на тРНК. Все приведенные выше данные позволяют предложить следующий механизм: тенк Е+ АТР+ АА — ~ — ь ьЕ.АА АМР— ~ АА-ТРНК+АМР+ Е. (7.15) РР Тем не менее одно время казалось, что с предположением об образовании в ходе реакции аминоациладенилата согласуются не все данные.
Был предложен другой механизм реакции — в присутствии тРНК аминоациладенилат необразуется, а реакция идет при одновременном взаимодействии тРНК, аминокислоты и АТР [52]. Как мы увидим ниже, этот механизм некорректен, хотя в свое время казался вполне приемлемым. Кроме того, необходимо отметить, что наличие парциальной реакции в отсутствие одного из субстратов (например, образование аминоациладенилата из аминокислоты и АТР в отсутствие тРНК) не означает, что аналогичная реакция имеет место в присутствии всех субстратов.
Действительно, в ряде случаев показано, что такие парцнальные реакции являются артефактом. Адекватность механизма с образованием аминоациладенилата очень просто доказать с помощью трех типов экспериментов с использованием метода замороженной струи, руководствуясь тремя критериями: промежуточное соединение должно быть выделено, оно должно достаточно быстро образовываться и достаточно быстро реагировать, чтобы реакция шла по данному пути [53]. При исследовании реакции с участием изолейцил-тРК вЂ” синтетазы (1Ю) получены следующие результаты: а.
При смешивании предварительно образованного и выделенного комплекса 1ЙЬ. [ЫС]1!е-АКР с тРНК константа скорости первого порядка для переноса ["С]Пе на тРНК, измеренная импульсным методом замороженной струи, оказалась такой же, как и й„1 для стационарного аминоацилирования тРНК в аналогичных реакционных условиях. Таким образом, константа скорости превращения промежуточного соединения достаточно высока, чтобы реакция шла собразоваииемдаиногосоединения, и, более того, эта реакция является, по-видимому, лимитирующей стадией процесса. б. При смешивании 1К8, изолейцина, тРНК и [у'ЕР] АТР (метка включена в концевой фосфат) наблюдается всплеск, регистрируемый импульсным методом замороженной струи, — высвобождение меченого пирофосфата, которое предшествует стационарному процессу аминоацилирования тРНК.
Это означает, что либо аминоациладенилат образуется до стадии аминоацилирования тРНК, и это, следовательно, является доводом в пользу адекватности данного механизма, либо ГЛАВА т 224 4 В г »и ф щ 0 1 2 Х ж Ярелгл, с Рис. 74. Перенос [ВС[1!е от 1ЙБ. ["С[Не АМР иа тРНКп' при смешивании указанного комплекса с избытком тРНК в устройстве, применяющемся в импульсном методе замороженной струи. 2 д Врамл, с Рис. 7.5. Высвобождение ["Р[пирафосфата при смешивании ["Р[АТР, изо. лейцииа, тРНК и фермента в устройстве, применяющемся в импульсном методе замороженной струи. Значение амплитуды всплеска концентрации продукта, полученное экстраполяцией, составляет менее одного моля ниро. фосфата иа моль фермента, поскольку концентрация АТР не является иасы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
