Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 39
Текст из файла (страница 39)
щающей (гл. 4, равд. Г). Светлые кружки — концентрация АТР равна 2 Ки, темные — 1 Км. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 285 реакция идет по такому пути, в ходе которого быстро образуется аминоацил-тРНК, а далее следует медленная стадия диссоциации комплекса 1Й$.1!е-ТРНК [схема (7.!6)]. Вметро Медленно Е+АА+АТР+тРНК, -ь Е.АА-тРНК ~ Е+тРНК. АМР+ РР (7.16) Этот путь, существование которого предполагали многие исследователи, исключается результатами третьего эксперимента ЦВ ГВ ьй ВРЕЛеа, С Рис.
7.6. Начальиая снорость ацилироваиия тРНКн' цри смешивании насы- щающих ноицеитраций (14С~Пе, АТР и тРНК с ферментом. (метод замороженной струи). Согласно схеме (7.!6), ацилирование ТРНК должно протекать в две стадии, поскольку образование одного моля связанной с ферментом аминоацил- ТРНК происходит быстро, а дальнейшее превращение осуществляется медленно. в. Оказалось, что при смешивании 1ЙБ, ['4С]1!е, ТРНК и АТР начальная скорость ацилирования ТРНК при экстраполяции идет в ноль, без каких-либо указаний на наличие начального всплеска. Всплеск, при котором высвобож- ГЛАВА Г дается пирофосфат, обусловлен образованием аминоациладенилата, которое предшествует переносу аминокислоты на тРНК (рис.
7,6). 2. Механизм корректирования биосинтеза белка В гл, 11 говорится о том, что в процессе биосинтеза белка клетка выбирает нужную ей аминокислоту со значительно более высокой точностью, чем можно было бы ожидать, исходя из структурных различий между аминокислотами. Эта точность может обеспечиваться специфически катализируемым аминоацил-тРНК вЂ” синтетазой гидролизом аминоациладенилатного комплекса, образуемого «ошибочной» аминокислотой, или неправильно «нагруженной» тРНК !51]. Примером такого рода процесса может служить «отказ» валил-тРН К вЂ” синтетазы (ЧК$) присоединять треонин вместо валина [54]. Этот фермент катализирует реакцию обмена РР чьАТР в присутствии треонина и, кроме того, образует стабильный комплекс ЧЯЯ.Тпг-АМР. В присутствии тРНК и треонина ЧКБ функционирует как АТР- пирофосфатаза, гидролизуя АТР до АМР и пирофосфата и не катализируя образование Тпг-тРНКч»1. В качестве промежуточного соединения в этой реакции образуется комплекс ЧВБ,Т11г АМР, о чем свидетельствует наличие обмена РР хь АТР.
Эксперименты с применением импульсного метода замороженной струи показывают, что механизм корректирования при ошибочном присоединении треонина основан на быстром гидро- лизе неправильно ацилированной тРНК. Такую тРНК можно выделить и показать, что она действительно гидролизуется с достаточно высокой скоростью. При смешивании комплекса ЧКЯ.[г»С]Тпг АМР с тРНКч" в аппарате, применяемом в методе замороженной струи, наблюдается кратковременное образование ["С]ТЬг-тРНКч»1 (рис. 7.7). Это соединение можно выделить, быстро остановив реакцию с помошью фенола и осадив неправильно ацилированную тРНК из водной фазы; такая РНК гидролизуется ЧК8 с константой скорости 40 с-' (рис. 7.8). Скорость переноса треояина от комплекса ЧкЯ.Тпг АМР можно измерить независимо по скорости высвобождения АМР (используя соединение ЧВВ.Тпг- ["Р]АМР; рис.
7.9). Сплошная кривая на рис. 7.8 построена исходя из результатов независимо. го измерения констант скорости образования и гидролиза [схема (7.17)]. чм Чйз.тьг АМРлРНК™ — » — » ЧЙБ.ТЬ»-~РНКч~!+ АМР (7 17) 40«-' Чав + тьг + «РНКч«~. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 237 гг гс ЗТ 7В а ' Г4 » гг ы ггг й ф б й 6 ~6 а 4 Рис. 7.7. Кратковременное образование [НС)ТЬгтРНК™ пои смешивании Тгйб.[НС1ТЬ вЂ” АМР с избытком тРЙК в устройстве, примеивемом в методе замороженной струи. гп 4с бс и угйг уйр ж уиелгя, с й 4 ф а к г и Рис.
7.8. Каталнзируемый валил- тРНК. синтетазой ('1ГКБ) гидролнз ошибочно ацилироваииой [НС[ТЬгтРНК™. йу га УС 4а СР Юа УС агами, мс ГЛАВА 1 Отметим один достойный внимания момент. Константу скорости деацилирования неправильно ацнлированной тРНК можно определить из данных предстационарной кинетики даже в 10 О 1О ОО ВО ОО ВО ВО Ю ВО ооаия, ага Рас. ттк Скорость распада Тог АМР пра смешаааааа Чнз. Таг- Ргр)АМР с избытком тРНК»". присутствии большого количества неацилированной тРНК. Методом стационарной кинетики это сделать нелегко из-за конкурентного ингибирования неацилированной тРНК.
Д. Миозиновая АТРаза: определение констант скорости ассоциации и диссоциации фермент-субстратного комплекса, исследование промежуточных конформационных состояний и равновесий методом остановленной струи с регистрацией флуоресценции, методом высвобождения протонов, измерением ферментативной активности при помощи вспомогательных ферментных систем, методом светорассеяния и методом замороженной струи Сокращение мышцы является результатом скольжения двух типов перекрывающихся нитей (филамснтов) — толстых, содержащих миозин, и тонких, содержащих актин. Между толстыми и тонкими нитями имеются поперечные мостики, составляющие КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МЕХАНИЗМ ДЕИСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ 939 часть молекулы миозина.
В ходе сокращения поперечные мостики многократно разрываются и вновь образуются. В мостиках расположены активные центры, катализирующие гидролиз АТР. АТРазная активность покоящейся мышцы крайне низка, а при сокрашении она возрастает в тысячу раз, Высвобождающаяся при гидролизе энергия используется для мышечного сокращения, Возникает вопрос: как связаны между собой химическая и механическая энергия? Согласно существующей гипотезе, взаимопревращения этих форм энергии осуществляется посредством конформационных изменений в белке, связанных с гидролизом АТР. Активные центры миозина, присоединяющиеся к актину, расположены в глобулярных участках молекулы миозина, которые получили название 51-субъединиц.
Они могут быть отделены от остальной части молекулы путем протеолиза. Полученные таким образом фрагменты более удобны для проведения кинетических исследований, чем целая молекула миозина [55]. Механизм гидролиза АТР с участием фрагмента $1 в том виде, в каком его сейчас представляют, довольно сложен — это последовательность реакций, состоящая из семи стадий [схема (7.18) ]. Несмотря иа всю свою сложность, эта схема вполне логична [56 — 68] .
й~ йз йз йв М+ АТР Ч-зз~ М.АТР Чззз~ М".АТР ~ ~М'*.АРР.Р й й, йв йв йз М'.АРР.Р ч===~ М'.АРР+ Р ~=='ь М.АГЗР ч==~ М+ А!ЗР. (7.18) й-в -в 1 Конформацнонные состояния обозначены звездочками; число этих звездочек отражает интенсивность флуоресценции трнптофана. Считается, что константы равновесия и константы скорости, полученные при исследовании скелетных мышцкролика при 2!'С и рН 8,0, имеют следующие значения: й /й 1 = 4,5 10' М; Аз=400 с ', й з(0,0003 с ', йз/л з=9; лз)160 с ', йв= = 0,06 с ', йз/!в в ) 1,5 10-' М; йв= 1,4 с-', й в=400 с-' и й17йз = 2,7 10-4 М [68].
Рассмотрим теперь, как была построена схема (7.!8). 1. Лимитирующая стадия гидролиза АТР Число оборотов для гидролиза АТР с участием миозина очень мало — всего 0,04 с-'. Исследования методом замороженной струи с использованием [умР]АТР показывают, что константа скорости расщепления АТР прн первом обороте фермента равна !60 с-' [60].
Это означает, что в стационарном состоянии лимитирующей является стадия, следующая за стадией химиче- ГЛАВА т ского расщепления. На этой стадии может происходить либо конформационное изменение, либо медленное высвобождение продуктов. Измерение скоростей диссоциации, которые оказались относительно высокими, показало, что имеет место конформационное изменение (равд. 2) [6!]. Медленная стадия характеризуется константой Й4 Поскольку изменение конформации сопровождается уменьшением интенсивности флуоресценции, эту константу измеряют методом остановленной струи с регистрацией флуоресценции; кроме того, ее можно определить по высвобождению протонов, так как на данной стадии на один моль гидролизованной АТР высвобождается один протон [64]. Константу скорости высвобождения протонов легко определить методом остановленной струи с регистрацией оптической плотности, используя окрашенный индикатор рН, в данном случае фенол красный.
2. Скорости высвобождения АРР и Р (фосфата) Первые опыты по определению скоростей высвобождения АРР и Р были весьма остроумными: скорость появления в растворе свободных АРР и Р определяли с помощью сопряженных ферментных систем и метода остановленной струи с регистра. цией оптической плотности [64]. а. Высвобождение АРР, сопряженное с исчезновением (4]АРН в реакциях, катализируемых пируваткиназой и лактатдегидрогеназой; А44Р АТР Фосфоаяолпируаат — — '~ Пяруват х, .ь Лактат. (7.
(9) !ЧАОН МАВ4 б. Высвобождение Р, сопряженное с образованием [4[АРН в реакции, катализируемой глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеназой: Р + МАВ4 НАОН лг р .-44 ~Д4 44 Х '44 АЭР АТР— ь 3-фоафогаиаерат. (7,26) (Глицеральдегид-З.фосфат превращается в (,З.дифосфоглицерат, который для предотвращения ингибирования первой реакции удаляется с помощью фосфоглицераткиназы, превращающей его в З-фосфоглицерат.) При высвобождении Р или АРР всплеска концентрации не наблюдается, так что либо оба продукта медленно отщепляются кинетические методы и механизм деиствия веиментов га с одинаковой скоростью, либо диссоциация происходит после завершения лимитируюшей стадии. Если бы высвобождение, скажем, АОР было медленным и являлосьлимитнруюшим,товысвобождение Р носило бы двухстадийный характер, и наоборот.
В ходе специальных экспериментов была определена константа скорости диссоциации комплекса Ьг.АОР; она оказалась раиной 1,4 с-'. Тио1ТР быстро связывается со свободным Вг, что сопровождается спектральными изменениями. При смешивании избытка тио1ТР с комплексом ВьАОР образование Бг.тио!ТР лимитируется диссоциацией ВьА1эР и, следовательно, скорость диссоциации ЗьА1лР определяется просто. 3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
