Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 30
Текст из файла (страница 30)
В отсутствие трнптофана (который обладает относительно сильной флуоресценцией) можно следить за флуоресценцией тирозина. д. Разностное титрование [251 Прямое титрование белка кислотой или основанием обычно дает не поддающуюся интерпретации кривую ионизации из-за перекрывания, обусловленного титрованием большого числа 1ВЕ ГЛАВА $ групп.
Однако, сравнивая кривые титрования фермента до и после блокирования определенной группы, удается выделить одну или две ионизирующиеся группы. Например, Азр-52 лизоцима можно специфически этерифицировать триэтоксифторборатом, Сравнение кривых титрования модифицированного и нативного белка не только дает рК, Азр-52, но и позволяет выявить влияние ионизации этой группы на свойства другой важной кислоты, входящей в состав активного центра,— О1п-35. е. Разностное титрование с переводом фермента в денатурированное состояние [26] Определить с помощью титрования состояние ионизации находящегося в глубине белковой глобулы остатка (например, Азр-102 в химотрипсине и химотрипсиногене) практически невозможно.
Из-за высоких фоновых концентраций гидроксилионов и протонов точное титрование удается осуществить только в диапазоне рН от 3 до 11. В связи с этим с помощью суммарной кривой титрования нельзя выявить ионизацию групп белка с аномальными рК,, Например, в химотрипсиие имеются три кар. боксильиые группы с аномально низкими рК. — они находятся в ионизированной форме при рН ( 3, Однако когда белок денатурирован, эти группы титруются нормально, а число титрующихся карбоксильных групп в денатурированном белке можно легко определить. Ионизация Азр-102 химотрипсина и химотрипсиногена при варьировании рН была установлена путем измерения числа поглощенных протонов при денатурации и сопоставления полученного результата с числом ионизированных карбоксильных групп в этих денатурированных белках. Для повышения точности большинство расположенных на поверхности карбоксильных групп было превращено в амиды, чтобы уменьшать число ионизирующихся групп.
ж. Химическая модификация Значения рК, аминокислотных остатков активного центра свободного фермента и комплекса фермента с ингибитором находят по результатам измерения скорости необратимого ингибироваиия ферментов точно так же, как и в случае обычной ферментативной кинетики.
рК, других остатков определяют из рН-зависимости скорости реакций этих соединений с различными реагентами. Например, поскольку амины, находясь в форме основания, реагируют с уксусным ангидридом ]27] или динитрофторбензолом 128 — 30], степень их ионизации определяется из относительных скоростей реакций при разных рН.
Этот подход был использован для определения рК, аминогрупп в белках. РН.ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 187 Аминогруппы модифицировали реагентами, меченными радиоактивными изотопами, затем белок гидролизовали, разделяли пептиды и измеряли их удельную радиоактивность. Таким способом можно найти рК, нескольких групп одновременно, что и было сделано для эластазы и химотрипсина. В видоизмененном варианте этого метода измеряется скорость обмена трития (из Т80) с протоном, связанным с С-2-атомом имидазольного кольца гистидина ]18, 31, 32]. Константа скорости обмена зависит от состояния ионизации имидазола и является более высокой для непротонированной формы. Описанный метод дополняет метод ЯМР, который также позволяет измерять рК, гистидина.
Эти эксперименты весьма трудоемки, однако с их помощью можно однозначно идентифицировать РК.. 3. Влияние температуры, полярности растворителя и ионной силы на рК, групп, находящихся в составе фермента и в растворе Полярные растворители стабилизируют ионы — электростатические диполи растворителя взаимодействуют непосредственно с ионами, а увеличение диэлектрической проницаемости средыуменьшаеттенденциюэтих ионов к реассоциации.
Ионизация нейтральной кислоты НА ]уравнение (5.38)] при добавлении к водному раствору слабо полярного растворителя подавляется (табл. 5.4) . НА А +Н". (5.38) Таблица Ю.4 Влинние органических растворителей на рх при 25 'Са) рк, цноксан, Чг глинка уксусная кнслога григи бенаонларгннкн -нн а -со,н 2,35 з,'и 9,78 9,29 8,49 0 20 45 50 70 4,78 5,29 8,'З) 3,34 8,0 8,0 8,0 8,0 8,'О 4,59 4,80 3,98 7,42 8,34 «) Нагпеб Н. З.. Опек В.
В, ТЬе рЬуа)са) снего(е(гу о( е!ес1го!упс ао!пион, Не)пЬоы, Хек Уогк, 755-б (1958); 1пааапг( Т., Зыг(снап( Л М„В)осман В)орЬуа. Ас! а, 88, бл (1900). б) (НОСИа)аоииа. ГЛАВА Ь С другой стороны, ионизация кислоты, несущей положительный заряд (ВН+), нечувствительна к полярности растворителя, по. скольку в равновесии не происходит изменения заряда. ВН В+ Н+. (5.39) Исследование влияния полярности растворителя на рКа группы, связанной с ферментом, не позволяет с определенностью ответить на вопрос, какая кислота ионизируется — нейтральная или несущая положительный заряд. Частично погруженная вглубь белковой глобулы кислотная группа экранирована от растворителя, и более существенным может оказаться электростатическое взаимодействие с другим группами белка.
Напри. мер, рК, ацилфермента, образованного бензоиларгинином и трипсином, почти не изменяется в смеси диоксан/вода в диапазоне концентрации диоксана от 0 до 50'7ь и лишь слегка возрастает, когда концентрация достигает 88% ]33]. Казалось бы, это должно соответствовать кислоте, несущей положительный заряд (иапример, ионизирующемуся имидазолу), поскольку в этих условиях рК, уксусной кислоты увеличивается приблизительно на 6 единиц, однако результаты исследований методами ЯМР- и ИК-спектроскопии указывают на то, что ионизируется карбоксильная группа Азр-102 ]17, 18].
Аналогичным образом, хотя увеличение ионной силы приво. дит к снижению рК, карбоксильных групп в растворе, рК, Азр-52 и 0!п-35 в лизоциме при увеличении ионной силы возрастает вследствие оказываемого ею влияния на поверхностный заряд белка ]25]. Энтальпия ионизации имидазольных групп в растворе составляет ЗО кДж моль-' (7 ккал моль-'), тогда как для карбоксильных групп эта величина пренебрежимо мала.
Следует иметь в виду, что на энтальпию ионизации оказывает большое влияние изменение энтальпии образующихсольватнуюоболочку молекул воды, поэтому данные, полученные для раствора, нельзя прямо переносить на случай частично погруженных в белковую глобулу групп. И. Аномальные значения рК, в ферментах Известно много примеров, когда амины, находящиеся в фор.
ме основания, и карбоксильные группы в белках имеют аномально высокий или низкий рК, (табл. 5.5). Причины этого явления крайне просты и объясняются особенностями микроокружения. Если карбоксильная группа, например, аспартата в системе с переносом заряда а-литической протеазы или химотрипсина находится в среде с относительно низкой полярностью, ри-ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ФЕРМЕИТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ Таблица Я.Я Некоторые аномальные значения рК, белковмх групп рка Остаток Фермент О!и-35 О!ц-35 Азр 1.уз (в-ННя) Пе-16 (а. ННя) СОяН 6,5 [25) 8,2 [25[ 6,7 [17) 59 [6[ 10,0 [[1[ 7,5 [20] Лнзоцим Комплекс лнзоцима с гликолхнтииом о-Литнческая протеаза Ацетоацетатдекарбоксилаза Химотрипсии о-Лактоглобулин СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1, О!хол М„В!осйтп.
3., 55, 161 (1963), 2. А!Ьег!у Я. А„Маяяеу У., В!осыпь Ь[орйуз. Ас(а 13, 347 (1954). 3. Велбег М. Е, С!етел! О. Е., Кбгду Р. Х., д'А Йесй Н., 3, Апь снеги. Зос., 86, 3680 (1964). 4, Регяй! А. Я., Яеуиела У., Л Ат, СЬегп. Бос., 93, 7079 (1971). 6. роя!тех у„регяМ А. Я., В!осйет!з(гу, 12, 1067 (1973). 6. Зейт!Я! О.
Е., Хг., Ятея!йе!тег Р. ™Н., В!осйет!з(гу, 1О, 1249 (1971). 7. Яелагб М., Регяй! А. Я., В!осйет1з(гу, 12, 4713 (1973). 8. Ретж А. Я„Яелагб М., В!осЬетЫгу, 13, 1416 (1974). 9. Ебяа!! Т. Т., Нгутал 7., В!орЬузка! сйет!з(гу, Асабегп!с Ргезз, Нем Уогй, р. 510 (1958). 10.
Кбгя(у Р, 7., С!етел! О. Е,, Велдег М. Е., 3. Агп. сйтп. Бос„86, 3690 (1964). 11, Регзй! А. Я., 3. пю1ес. В!о1., 64, 497 (1972) (см. также ссылка, приведен. ные в втой работе). 12. Рел!г Ео Тйогл!ол Е. Я., Л. Агп. сЬет. Зос., 89, 6931 (1967). 13. Магй!еу А 1... Асс(з сйет. Яез„ 8, 70 (!975), 14. Магжеу 7 Д, В1осйет!в(гу, 14, 3546 (! 975). 16. Дудкин С. М., Карлейский М. Я., Сахароескиу В. Г., Яковлев Г.
Ии ДАН СССР, 221, 740 (1975). 16. Яоы!!агд О., Зйи!тал Я. О., Л пю!ес. В!о1., 86, 519 (1974). 17. Нилйарн!ег М. В'о Зта!!сотйе 3, Н., ТУА!!айег О, Яо Я!сйагг(я Е Н., В!осЬет!з(гу, 12, 4732 (1973). 18. Коерре Я. Е. П, 3!гоаб Я, М., В!осйет!з!гу, 15, 3450 (1976). 19, Кагр!ия Зо Блудят О. Н., Зуйея В. О., ВюсЬеппжгу, 12, !323 (1973). то ее рК, будет повышен, поскольку в этих условиях анионная форма дестабилизируется. С другой стороны, если карбоксилатион образует ионную связь с аммоний-ионом, то он будет стабилизироваться положительным зарядом и станет более кислым. И наоборот, если аминогруппа имеет неполярное окружение (например, аминогруппа лизина в ацетоацетатдекарбоксилазе), то ее протонирование подавляется и рК, понижается, Аммонийион, образующий в химотрипсине ионную связь с остатком 1[е-16, стабилизируется отрицательным зарядом карбоксилатиона; его депротонирование подавпяется, и рК, возрастает, Глава ПРАКТИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА Одним из необходимых условий проведения любого кинетического исследования является наличие удобного метода измерения скорости образования продуктов или скорости расходования субстратов.
Для проведения подобных измерений используются самые разные методы, начиная с таких классических методов, как манометрический, вискозиметрический и поляриметрический, и кончая самыми современными — ЯМР и ЭПР. Однако наиболее широко применяются спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, автоматическое титрование, а также методы с использованием субстратов, меченных радиоактивными изотопами.
В этой главе мы не будем рассматривать всех имеющихся методов, а остановимся только на самых распространенных, да и то ограничимся лишь областью их применения и практической стороной вопроса. А. Кинетические методы 1. Спектрофотометрия Многие соединения поглощают свет в ультрафиолетовой или видимой областях спектра, Если интенсивность света, падающего на раствор вещества, равна 1м интенсивность света, прошедшего через этот раствор,— 1, то поглощение А равно А = !я (1о11).
(6.1) Согласно закону Ламберто — Бэра, А =ес1, (6.2) где е — коэффициент поглощения (или экстинкции) данного соединения, с — его концентрация (обычно молярная), а 1 — оптический путь, или толщина образца (в см). Спектрофотометрический анализ особенно ценен для исследования природных хромофоров.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
