Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 29
Текст из файла (страница 29)
виснмосты параметра Лез~/Км для катализируе. мого б-хнмотрнпсииом гидролиза п-нвтрофени. лового эФира М-ацетил- Ь-трыптофаиа ~71. М 8 Рис. 5.5. Определение К. активного центра -химотрнпсииа из рй зависимости й,. /К для реакции гидролиза М-ацетил-Ь.тирозиы.п-ацетил. аиилыда 671. рН-ЗАВИСИМОСТЪ СКОРОСТИ ФЕРМЕНтАтиВНЫХ РЕАКЦИЯ )8! Тпблица Ю.З ргч автивиого центра аимотрипсииа рк, Источннн Нанныха) Субстрат Алаиииамид ацетил-Ь-феиилалаиииаб) Семинарбазид формил-Ь-феиилаиииаб) и-Ацетилаиилид ацетил-Ь-тирозииаб) и-Нитрофеиилацетатб) Этиловый эфир ацетил-Ь-феиилалаиииаз) л-Ацетилаиилид ацетил-Ь-тирозииа п.Нитрофеииловый эфир ацетил Ь-триптофаиа") 6,6 6,32 6,80 6,77 6,88 6,8 6,83 6,80 6,9 а) 1-пегом А. Ц, Цепагб М., В)оспам)а!гу, 12, Н!б (1924).
2 — Вепбег Н, 1... Гиетеп! О. Е., Кегбу Р. А, Нес1г Н. б'А., Л Ам збао (1294). З вЂ” Нам!попа В. ц.. Опигеппб И., В)осЬепс А, б(, )М ((заб). 4 — Цепагб М.. Регав( А. Е„в(о Ьем!а!гу, 12, 4212 (12)З). б) и-Хннотрнпснн. 2б 'С, познан сила О,!. е) б-хннотрнпснн, 2б 'С, ноннае снла ОДК СЬ . С а„аб. б. л-Нитрофениловый эфир ацетил-Ь-триптофаиа! механизм Бриггса — Холдейна с изменением природы лимитирующей стадии при варьировании рН Исключение, о котором упоминалось выше,— это рН-зависимость й„!%м для гидролнза н-нитрофенилового эфира ацетил-1-триптофана.
В этом случае кажущийся рК свободного фермента равен 6,50. Причина такого низкого значения рК, была рассмотрена в равд. В.2. При высоком рН стадия связывания субстрата с ферментом является отчасти лимитирующей. чение рК„ равное рК, свободного фермента.
За исключением единственного случая, это предсказание теории подтверждается. При 25'С и концентрации соли 0,1М рА; активного центра химотрипсина равно 6.80~ 0,03. Наиболее точные экспериментальные данные очень хорошо совпадают с теоретическими кривыми ионизации в диапазоне рН 5 — 8 после внесения поправки на долю фермента, находящегося в неактивной конформации. Это соотношение справедливо для гидролиза амидов, где не происходит накопления промежуточных соединений и выполняется механизм Михаэлиса — Ментен, а также для гидролиза эфиров, где накапливается ацилфермент (табл.
5.3 и рис. 5.5 и 5.6). ГЛАВА 5 гзр Предельное значение А„!/Км при высоком рН равно 3 1О' М-'с-', что близко к величине, характерной для лимитируемых диффузией частот столкновений фермента и субстрата. Однако при низких рН химические стадии замедляются и по мере протонирования фермента и уменьшения его активности становятся лимитирующими, Константа скорости для стадии связывания, которую можно рассчитать изуравнения (5.31), равна 6 10'М вЂ” 'с-'.
Эти данные находятся в соответствии со схемой (5.35) и значением рК. = 6,8 для активного центра !7). мм' м-'с-' Ас-ТгрОМРЬ+ Е, ' Ас-ТгрОМРЬ ° Е 5 1О' с-' 710 с Ас-Тгр-Е ,'155 с Ас-Тгр+ Е (5.35) (Š— химотрипсин). Это редкий случай, когда анализ стационарной кинетики позволяет получить константы скорости для ряда конкретных стадий реакции. в. Фермент-субстратный комплекс г.
Ионизация прн высоких значениях РН 111) Высокое значение РК, обусловлено не зависящим от субстрата изменением конформации фермента, которое можно выявить физическими методами„например сняв спектры кругового рК, фермент-субстратного комплекса не является величиной постоянной, как в случае свободного фермента, поскольку связывание субстратов изменяет РК, активного центра. Значение рК„ полученное из РН-зависимости Аса! для гидролиза амидов, колеблется в пределах 6 — 7. Соответственно значение Км возрастает при низком РН в согласии с уравнением (5.16).
Точное определение рК, фермент-субстратного комплекса из РН-зависимости Км затруднено по двум причинам, Во-первых, изменение Км относительно невелико и требуется высокая точность при получении данных. Во-вторых, необходимо определить две области плато: при низком и при высоком значениях рН, Это означает, что измерение нужно проводить в более широком диапазоне РН, чем при определении Йса! или Йса!/Км а при этом возникает опасность появления нежелательных эффектов, обусловленных ионизацией других групп.
рн.зАВисимость скОРОсти ФепментАтивиых РеАкцин 183 дихроизма или определив квантовый выход флуоресценции. Кинетические измерения дают такое же значение рК„как и эти методы. 6 7 а рл Рис. 8.7. Увеличение Км при низких рН для катализируемого хнмотрнпсином гидролнза Ы-формил-(.-феннлаланипсемикарбазнда (71 и формнлгидразнда (И), связанное с тем, что рК, фермент-субстратного комплекса ниже рК. свободного фермента [81. Ж.
Прямое титрование групп в ферментах Существует несколько методов прямого титрования определенных ионизирующихся боковых цепей в белках. Одна из основных проблем заключается в идентификации данной группы. 1. Влияние РЕО иа рН/рР и рК, Во многих спектроскопических методах в качестве растворителя вместо НаО используют 0зО, что позволяет разделить нужный сигнал и сигналы, обусловленные растворителем. Экспериментально установлено, что рО, измсренныйстеклянным электродом, на 0,4 единицы ниже рН: рн=рп+О,4. (5,36) ГЛАВА 3 !84 рН в смеси Н,О и О«О, измеренный стеклянным электродом, определяется соотношением [12] рн ро + 0,3! Зэа + 0,0884ай (5.37) где а — относительное содержание дейтерия, т.
е. [О)/([О]+ + ]Н] ). Однако в растворе 0«О и в смеси 0«0/Н«О значение рК, выше, чем в водном растворе. Иногда увеличение рК. компен. сирует уменьшение показаний прибора со стеклянным электродом, и значение рК„измеренное в О,О, становится равным истинному рК. соединения в водном растворе. Влияние растворителя на константу ионизации непостоянно; недооценка этого факта может привести к ошибке в несколько десятых единиц рН. 2. Методы а. Ядерный магнитный резонанс: гистидиновые остатки [13] Метод ЯМР особенно ценен для определения рК, гистидиновых остатков в белках. Сигналы от протонов при углеродных атомах С-2 и С-4 сдвинуты в слабопольную область по отношению к сигналам от остальных атомов данной белковой молекулы и могут бытьразрешеныврастворах Р«О.
При протонировании происходит изменение величины химического сдвига и, следовательно, гистидиновые группы можно легко оттитровать, Когда в белке присутствует более чем один гистидиновый остаток, возникают трудности, связанные с идентификацией отдельных рК,. Решить эту задачу для рибонуклеазы помогли химическая модификация, избирательное дейтерирование и выяснение кристаллической структуры данного фермента; в настоящее время идентифицированы рК, всех четырех гистидиновых остатков рибонуклеазы !14, 15].
Сигнал ЯМР протонов, участвующих в образовании водородных связей, может быть сдвинут в слабопольную область настолько сильно, что его удается зарегистрировать в растворе Н«0. Обнаружено, что в химотрипсиногене, химотрипсине и других сериновых протеазах между Лзр-102 и Н(з-57 находится протон, и установлено, что он титруется с рК, = 7,5 [16) (хотя этот рК, относится к диссоциации протона, связанного с другим атомом азота имидазольного кольца)' ~о; — с 'нн — ~ ~~о < ~м "НЬ Одна из сериновых протеаз, а-литическая протеаза, которая, как полагают, имеет в активном центре аналогичную «систему с рн-ЗАВНСНМОСТЬ СКОРОСТИ фЕРМЕНТАТНВНЫХ РЕАКЦнй переносом заряда», содержит только один гистидин.
Измерение величины химического сдвига для "С, который включен в С-2-положение, дает рК, = 6,7, Однако в отличие от модельных соединений константа взаимодействия между этим атомом углерода и связанным с ним протоном не изменяется при изменении рН. По-видимому, группа, титрующаяся с рК, = 6,7, принадлежит Азр-102, а не гистидину, как всегда предполагалось [17]. Этот вывод подтверждается данными титрования карбоксильной группы с помощью ИК-спектроскопии (см.
ниже) [18[, ЯМР-спектроскопия на ядрах "С позволяет определить рК, остатков лизина и аспартата. Ионизация остатков тирозина исследовалась с помощью ПМР. б. ИК-спектроскопия [18, 20, 211 Карбоксильные группы поглощают электромагнитные волны с частотой — 1710 см-', а карбоксилаты — с частотой 1570 см-', Раэностные ИК-спектры, снятые в П»О, позволили определить рК, необычных карбоксильных групп я-лактоглобулина (7,5), лизоцима (2,0; 6,5) и трипсина (Азр-102; 7), в. Разностная УФ-спектроскопия [22, 231 Разностная УФ-спектроскопия часто используется при исследовании ионизации фенольного гидроксила тирозиновых остатков, а также при изучении свойств сульфгидрильных групп цистеина и имидазольных групп гистидина.
г. Флуоресцентный анализ [22, 24) Этот метод весьма полезен в тех случаях, когда при ионизации группы изменяется спектр флуоресценции соседнего с ней триптофана — главного флуоресцирующего остатка в белках, или происходит конформационное изменение в белковой молекуле, изменяющее спектр флуоресценцни белка в целом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
