Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 24
Текст из файла (страница 24)
7.!0). 7. Экспериментальное исследование кинетики переходных процессов Ниже (гл. 7) мы рассмотрим ряд примеров успешного применения исследования кинетики переходных процессов для выяснения механизма ферментативных реакций, а пока кратко обсудим стратегию и тактику, применяемую при постановке ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 151 таких опытов. Во многих случаях, приступая к этим исследованиям, экспериментатор имел перед собой четкую задачу, кото.
рую он хотел решить. В других случаях исследование проводилось просто с целью накопления информации. Как бы то ни было, всегда необходимы воображение и умение продумать и поставить эксперимент. При этом весьма полезен следующий систематический подход. Анализ времени релаксации можно разделить на две основные части: !. Следует отнести время релаксации к определенному фи. зическому событию. 2. Это физическое событие необходимо «встроить» в общий кинетический механизм изучаемого процесса. Рассмотрим два примера. Первый пример — исследование связывания лиганда ферментом в ходе некатализируемой реакции.
При этом могут произойти два физических события: связывание и индуцируемое лигандом конформационное изменение фермента. Чтобы установить число промежуточных стадий и определить соответствующие им константы скорости, прежде всего необходимо определить число времен релаксации и найти их концентрационную зависимость. В идеальном случае число времен релаксации будет равно числу стадий данной реакции. Если найдено даже одно время релаксации и его концентрационная зависимость нелинеййа, это может означать, что процесс протекаег в две стадии !например, уравнения (4,7!) и (4.74)].
Далее стоит воспользоваться несколькими физическими методами (например, исследовать флуоресценцию и поглощение лиганда и белка), поскольку некоторые стадии могут быть выяв. лены только с помощью одного из этих методов. В ходе рассматриваемой реакции могут протекать и другие физические процессы, например отдача или присоединение протона или изменение степени агрегации белка. В первом случае весьма полезен еще один метод — измерение рН, для чего можно использовать просто цветные индикаторы.
Агрегация осложняет кинетические исследования, однако ее можно обнаружить и количественно охарактеризовать, что также даст дополнительную информацию. Для исследования простых реакций релаксационные методы часто оказываются эффективнее струевых, поскольку позволяют изучать более быстрые процессы. Однако иногда метод остановленной струи более ценен, например, при исследо. ванин процессов, слишком медленных, чтобы применять метод температурного скачка.
Кроме того, некоторые эксперименты (такие, как исследование влияния сильных изменений рН) можно осуществить только в том случае, если использовать методы, включающие быстрое смешивание реагентов (хотя небольшого изменения рН можно добиться, применив метод темпера- !52 ГЛАВА 4 турного скачка с использованием буфера, рК. которого зависит от температуры). Второй пример — исследование механизма действия фермента в условиях протекания ферментативной реакции. Помимо определения стадии связывания и выявления конформационных изменений, в этой реакции необходимо исследовать стадии образования и разрыва связей и идентифицировать промежуточные соединения.
Химические процессы обычно лучше всего исследовать методами, которые позволяют прямо измерить кон. центрацию химических соединений, например методом остановленной струи с регистрацией оптической плотности раствора и методом замороженной струи. Иногда лучше воспользоваться косвенными методами, например методом флуоресцентного анализа. Идеальной для исследования является такая ситуация, когда промежуточное соединение накапливается и его можно обнаружить и измерить концентрацию. Вообще для подтверждения имеющихся данных и получения новых следует привлекать возможно большее число различных методов.
Примеры применения таких методов даны в гл. 7. Г. Абсолютные концентрации ферментов 1. Титрование активных центров и начальный «всплеск» концентрации продукта Для расчета констант скорости из данных стационарной ки- нетики и определения стехиометрии связывания необходимо знать концентрацию активных центров ферментов. Рассчитать эту величину исходя из молекулярного веса белка и его концен- трации нельзя, поскольку не всегда удается выделить абсолютно чистый фермент. Проблема определения концентрации была ре- шена путем применения метода титрования активных центров н сочетанием исследования ферментативных реакций в стацио- нарных и предстационарных условиях, позволяющих связать концентрацию активной формы фермента с начальным вспле- ском концентрации продукта. Начальный всплеск наблюдается в тех случаях, когда по ходу реакции происходит накопление связанного с ферментом промежуточного соединения. Первый моль субстрата быстро реагирует с ферментом с образованием стехиометрических количеств фермент-содержащего промежу- точного соединения и продукта, а дальше реакция замедляется, поскольку идет медленный распад промежуточного соединения с высвобождением свободного фермента: А', ь е+8 — ~ е! — ' е + + Р~ Рз измврннив констант скорости оврмвнтативных ркакцип 153 Очевидно, что если стадия, характеризующаяся константой йп протекает очень быстро, а стадия с константой яа — крайне медленно, то высвобождение Р, легко зарегистрировать и связать его количество с концентрацией фермента.
Однако на практике йи редко бывает пренебрежимо малой величиной, поскольку за начальным всплеском концентрации Р, следует постепенное накопление этого продукта по мере превра[цения промежуточного соединения. Математически эта ситуация была И Время Рис. 4.10. Принцип титровании активных центров. — [е[, 1~',[[~', .[ [,1Г (4.77) Отметим, что амплитуда связана с константами скорости квадратичной зависимостью. Если отношение я[/яи достаточно велико, то квадратичный член близок к единице и амплитуда всплеска концентрации продукта равна концентрации фермента.
В противном случае концентрация будет занижена, если только не будут измерены и подставлены в уравнение (4.77) обе константы скорости. описана ранее [уравнения (4.35) — (4.44)). Выло показано, что всюду, за исключением начального периода, суммарное количество высвобождаемых продуктов зависит от времени линейно.
Из уравнения (4.44) видно, что линейная экстраполяция к нулевому моменту временно дает амплитуду всплеска и, которая определяется выражением ГЛАВА ч 2. Зависимость амплитуды всплеска от концентрации субстрата Константа й;, входящая в уравнение (4.76), представляет собой кажущуюся константу скорости первого порядка для ре. акции образования промежуточного соединения при данных усч $ й 8 гО 6 гб Время, мин Рнс.
4Д1. «Начальное» твтрованве актвввых центров (Наг11еу В. 8., К)(- Ьу В. А., В)ос)геш. з., 56, «88 (1954)). Хнмотрнпснн в указанных на рисунке концентрациях смешнвалн с и-ннтрофеннлэтнлкарбонатом (Е(ОСОТ вЂ” ѻɫ— — )ЧО»). Ацнлфермент Š— Π— СООЕ1 образовывался быстро, а гндролвзовался медленно. Отметим, что во время всплеска высвобождается около 0,63 моль и-ннтрофенола на 1 моль фермента.
Либо чистота (актнвность) фермента со. ставляла только 63«)«, либо константа скороств образования ацнлфермента не настолько превышает константу скорости деацнлнрованвя, чтобы ацвлфер- мент мог накапливаться. ловиях. Обычно в таких случаях применимо уравнение Михазлиса — Ментен, т. е. А А ° (811((81+ )(м) (4.78) где А..г и Км относятся к первой стадии. При достаточно малых концентрациях $ всплеск отсутствует, а при более высоких и при ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 155 условии, что й„! много больше й,, вновь появляется.
Подставляя (4.78) в (4,77), получаем Еесли йсм»йт, то уравнение (4.79) можно использовать для экстраполяции амплитуды всплеска к малым концентрациям 8, исходя из значений, полученных при различных концентрациях субстрата. Очевидно, что когда йа не является пренебрежимо малой величиной, следуе~ соблюдать осторожность, чтобы не получить заниженное значение концентрации фермента.
(4. 79) 2 в. аг () 2 4 5' !удемя, лгал Рис. 4.12. Тнтрование активных центров изолейцнл-тРНК вЂ” синтетазы с использованием только !О мкг (100 пмоль) фермента (0,1 мл 1 мкМ раствора фермента). Последовательность реакций танова: Е+ Не+ [умР)АТР— ~ Е1!е АМР— — — ~ Е+1!е+ АМР н,о [Регзы А. И., Кае!)гпег М. М., В!осйегп!з!гу, 15, 818 (1976).) промежуточное соединение. Чаще концентрацию активных центров определяют с помощью анализа скорости реакции. Недостаток этого метода состоит в том, что он не позволяет найти 3. Определение концентрации активных центров, исходя из анализа скорости ферментативной реакции Титрование активных центров применимо не всегда, поскольку для этого необходимо, чтобы в ходе реакции накапливалось ГЛАВА 4 абсолютную концентрацию фермента, если не проведена калибровка по данным титрования активных центров, Кроме того, скорость реакции зависит от условий.
Если в данной лаборатории эти условия могут поддерживаться более или менее постоянными, то от лаборатории к лаборатории они чаще всего варьируют. Для спектрофотометрического титрования активных центров необходимо несколько миллиграммов фермента; при использовании радиоактивной метки это количество можно уменьшить в 1000 раз ]!1]. Метод титрования активных центров с его относительной нечувствительностью к условиям, в которых проводится реакция, и возможностью определять абсолютные концентрации фермента наиболее ценен для получения воспроизводимых данных и для сравнения констант скорости, полученных с помощью стационарной и предстационарной кинетики.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
