Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 22
Текст из файла (страница 22)
2. Ядерный магнитный резонанс [7 — 10) Иногда с помощью ЯМР можно измерить константы скорости диссоаиапии комплексов между ферментом и ингибитором. В сочетании с константами связывания для данной реакции это позволяет получить константы скорости ассоциации. В.
Анализ предстационарной кинетики и кинетики релаксационных процессов В простых случаях дифференциальные уравнения для меняющихся со временем переходных процессов решаются относительно просто. Однако важно понимать, почехгр данному случаю соответствует именно данная форма решения.
В настоящем разделе мы сосредоточим наше внимание на интуитивном подходе к решению этой проблемы. Понимание сути вещей поможет нам избежать ошибок в алгебраических выкладках, а кроме того, мы сможем находить решение для некоторых сложных кинетических схем просто по виду этих схем. 1. Простые зкспоненциальные функции а.
Необратимые реакции Предположим, что соединение А превращается в В с кон. стантой скорости первого порядка й~ и эта реакция идет до конца: Аг А — и. (4. 1) В таком случае — = — А [А) (4.2) ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ Интегрирование уравнения (4.2) дает (4.3) где [А]о — начальная концентрация А. Поскольку [А[ + [В[ = [А[,„ то (4.4) [В[з [А[е (1 ехр ( А~1)) ! (4.5) Как [А], так и [В] являются простыми зкспоненциальными функциями. Заметим, что время полупревращения 1ч, для реакции, в которой [А] = [В] = [А]е/2, задается уравнением ехр( — йй) = я ° 1 (4.6) т.
е. (4.7) б. Метод начальных скоростей Рассматривая более сложные примеры, мы воспользуемся методом начальных скоростей, чтобы проиллюстрировать физический смысл некоторых выражений. Этот метод часто применяется при изучении процессов, слишком медленных, чтобы использовать полное время реакции, а также в том случае, когда в системе протекают побочные реакции. Начальная скорость ое реакции (4.1) равна ье Аз [А[в.
(4.8) Константа А1 определяется путем деления ое на ожидаемое изменение' концентрации реагента, следовательно, А~ —— ь /Ь [А[. (4.9) а. Обратимые реакции В атом случае А превращается в В не полностью, а концентрация А достигает равновесного значения. А1 Л ~~ В. (4.10) Аг ' При полном завершении реакции.
— Прим. ред, ГЛАВА Е Для данной реакции К„= [вИА] = «,7«, (4.11) — = — «» [А] + «, [н!. г[ ]А] (4. 12) Подставляя выражение для [В) из уравнения (4.4), получаем — — «» [А]+ «([А] — [А]) г[ [А] (4.13) Это уравнение можно проинтегрировать, разделив переменные и умножив каждую его часть на экспоненциальный множитель. — + [А](«, + «;)-«, [А],, г[ [А] (4.14) — ехр(«»+«г)»+[А](«»+«г)ехр(«»+«г)» «г]А]оехр(«»+«)» (4.15) г[ ]А] Отсюда г[ ([А] ехр («»+ «г)») = «г [А]о ехр («» + «г)».
После интегрирования получаем «, [А] ехр («»+ «)» ' [А] ехр («»+ «)»+ сспхк (4.16) » г Используя начальные условия, состоящие в том, что прн» =0 [А! = (А!е, а при » = оо равновесная концентрация А, [А],ч, есть [А]ее [А1е «гl(«»+ «г) (4.17) из уравнений (4.4) и (4.11) получаем решение (4.18) Выражение (4.18) для изменения во времени концентрации реагента А можно разделить на различные множители. Первый из них — экспоненциальный член, который содержит константу скорости, или — в терминах релаксационной кинетики — величину, обратную времени релаксации 1/т, равную !/т = «» + «г ! (4.19) а второй — амилитуднь»й фактор «»7(«г + «г)' (4.20) ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИЗНЫХ РЕАКЦИИ 139 Для обратной реакции, т. е. для реакции, в которой исходным вешеством является В, а не А, можно записать [в[, = 1 1' [А„схр (- (ь, + ь,) г) + А,].
(4.21) 1 г Время релаксации для этого выражения такое же, как и для уравнения (4.18), но амплитудный множитель иной. Первый важный момент, который необходимо отметить, состоит в том, что константа скорости для процесса приближения к равновесию больше каждой из индивидуальных констант скорости, Йг и йн и равна их сумме. Это легко понять, если проанализировать выражение для начальных скоростей. Начальная скорость в случае обратимой реакции (4.10) такая же, как н в случае необратимой (4.1), однако глубина последней реакции не столь велика, как первой.
Например, до заметного накопления продукта В в системе будет присутствовать только реагент А, следовательно, уравнение "о = А~ [А [а останется в силе. Однако суммарное изменение [А] определяется теперь уравнением (4.22) А [А[ [А[ — [А[, . Подстановка выражения (4.!7) дает О [А[а [А[а ь~/(ь~+ Аг) (4.23) откуда 1/т оз/А [А[а Гг~+ Ггг. (4.
24) Второй момент состоит в том, что константы йг и й, нельзя определить, не зная амплитудный множитель. Симметричность выражения для времени релаксации относительно констант скорости прямой и обратной реакций встречается во многих случаях, и, как правило, константы скорости мономолекулярных реакций нельзя рассчитать, не определив предварительно равновесные концентрации А и В. Позже мы увидим, что если реакция вследствие присутствия второго реагента является не мономолекулярной, а псевдомономолекулярной, то время релаксации будет зависеть от концентрации, что позволит устранить указанную выше трудность.
2. Связывание субстрата с ферментом е+ в ч==ь ез, (4. 25) Если [8] » [Е], то имеет место реакция первого порядка, поскольку [8] меняется лишь незначительно. Если константу скорости второго порядка для связывания фермента с субстра- 140 ГЛАВА 4 том обозначить через й,„, а константу скорости для диссоциации образующегося комплекса — через йеы, то уравнение (4.25) можно записать в более компактной форме: аеа РВ1 Е ч----=е Ез аоп Исходя из уравнения (4.19), получаем время релаксации для втой реакции: !/, = А.п+ А.„(з). ! (4.27) Следует отметить два момента: а) когда константы скорости являются псевдо.мономолекулярными, время релаксации зависит от концентрации, так что й,„ и йоы можно определить, не 40 гп 4! б гр гб гг гпчгсоаа7, 44саг Рис. 4.6. Свазываиие тирозииа тирозил-т.РНК вЂ” сиитетазой из В.
з!еаго!Аег. а4орз!1из (Регащ А. й., Ми1теу Н. $., Коан Сс. 1.. Е., Е!оснего!41гу,!4, 13 (197оЦ. зная амплитудного множителя; б) существует нижний предел для 1/т: зта величина не может быть меньше йоп. Это налагает определенные ограничения на значения констант, которые можно измерить. С помощью чувствительного спектрофотометра, применяемого для регистрации в методе остановленной струи, можно измерить только константы скорости, не превышающие 1000 с-', а константы скорости диссоциации многих ферментсубстратных комплексов имеют более высокие значения.
ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 141 Рассмотрим пример, приведенный на рис. 4.6. Константа скорости диссоциации комплекса тирозина с тирозил-ТРНК— синтетазой невелика, а потому константы скорости ассоциации и диссоциации удается измерить методом остановленной струи.
(Отметим, что иногда двухстадийный процесс можно ошибочно принять за рассмотренную выше одностадийную реакцию; см.разд. 6.) В тех случаях, когда субстрат в фермент-субстратном комплексе не претерпевает химического превращения (например, в отсутствие косубстрата в мультисубстратной реакции) или когда речь идет о связывании ингибитора, метод температурного скачка является наиболее ценным методом определения констант скорости связывания лиганда. 3. Последовательные реакции а. Необратимые реакции Простейший случай последовательных реакций изображен на следующей схеме: А — Р — ~" С, (4.28) Используя уравнения материального баланса и способы интегрирования, примененные выше, нетрудно получить уравнения для изменения концентраций А, В и С во времени; (4.29) — О А~ [А) — Аз [В).
д [В) Ы (4.30)  — промежуточное соединение, которое образуется и затем исчезает. Если Й1 »Аг, то оно образуется с константой скорости йь а затем медленно распадается с константой скорости й,. Если же йз»йн то В достигает стационарного уровня с константой скорости Йг и медленно распадается с константой скорости йь Парадокс состоит в том, что промежуточное соединение кажется образующимся с константой скорости его распада и распадающимся с константой скорости его образования. Это легко понять, проанализировав выражение для начальной скорости.
При й~<<йз концентрация соединения В достигает стационарного значения: 142 ГЛАВА 4 Стационарная концентрация В дается уравнением [В]зз — ' [А]о (т. е, «ь [А]о) (4.3[) и "а= «~ [А]о. (4.32) Отсюда !)~=,)[в]з =а, (4 33) В последнем случае, когда йз ) йь концентрация В очень низка, а в первом, при й, йь В накапливается. Эти два случая можно дифференцировать, варьируя [В].
40 0 1 У 0 1 г 0)гемл, с А н Рис. 4.7. Временные зависимости концентрация реагентов А, В и С для реек. ции А-н В -ь С [уравнение [4.28)], А. А1 = 1О с †', А, 1 с-Л Б, й, = 1 с-Л лн = 1О с †'. Заметим, что а) ход кривых для [С] в обоих случаях одинаков; б) кривые для [В] имеют одинаковую форму н различаются только амплиту.
доа; в) концентрация вещества А в первом случае уменьшается в 1О раз быстрее, чем во втором. Таким образом, если ие измерять концентрацию А, то различить зги два случая только на основании определения констант ско- рости нельзя. Подобная ситуация иногда возникает в экспериментах по ренатурации белка, когда за кинетикой процесса следят по изменению его флуоресценции. При таких условиях выявить двухфазную кинетику нельзя, если только не известен квантовый выход образования промежуточного соединения, позволяющий определить его абсолютную концентрацию. Пример применения рассмотренных выше уравнений приведен в гл. 7, разд.
Г. Аминоацил-тРНК вЂ” синтетаза, специфически этерифицирующая молекулу тРНК, которая присоединяет валин, «исправляет» ошибку, в результате которой образуется аминоациладенилат с треонином, по следующей схеме: Псрснос Гндроннз Е.ТЛг АМР.тРНК вЂ” ь Е.ТЛг-тРНК вЂ” ь Е+ ТЛг + тРНК. АМР (4,34) ИЗМЕРЕНИЕ КОНСТАНТ СКОРОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ 143 б. Квазиобратимые реакции: стационарное состояние Более общим случаем ферментативной реакции является процесс, протекающий согласно следующей схеме: ОАЗ АŠŠ— -Р Е8' — ~ Е РЕ РЕ (4.35) Например, химотрипсин реагирует с л-нитрофенилацетатом (АСО]х]р) в соответствии с вышеприведенной схемой (когда для первой стадии [АСОХр) ((Кз) с образованием промежуточного соединения ацилфермента (ЕАс): А, 1ААОНР! н,о Е ЕА Е йо[ЧР АсОН (для этой стадии Ае = лоро/ехм).
Поскольку ацилфермент постоянно образуется и распадается, его концентрация является стационарной (при условии, что (АСО[х[р)» (Е) ). Стационарная концентрация ацилфермента задается уравнением — [ЕАс] =О= А [АсОХр] [Е] — А [ЕАс]зз. 4 (4.37) Далее, поскольку [Е] + [ЕАс] = [Е]о О = А1 [АСО[чр]([Е]о — [ЕАс]) — А [ЕАс] (4.38) (4,39) АА [АСО[Чр] [Е]о Ае+ Ае [АсО[Чр] ' Воспользовавшись уравнением начальной скорости оо А1 [е[о [АСО[чР] (4.40) (4.4!) получаем 11т Р,/[ЕАс]зз = А + А, [АСО[Чр]. (4.42) (4.43) Точно так же, как в случае обратимых реакций, промежуточное соединение образуется с константой скорости, которая Как будет показано, скорость исчезновения Е.Т[1г АМР.тРНК можно прямо измерить по скорости образования АМР, концентрация промежуточного соединения Е.Т[1г.тРНК определяется непосредственно, а вторая стадия (гидролиз) исследуется независимо, путем выделения неправильно этерифицированиой тРНК и добавления ее к ферменту.
144 ГЛАВА 4 больше константы скорости превращения предшествующего промежуточного соединения. Аналитическое выражение для накопления во времени НО]]р имеет вид [НОЫр] (Е]е, ' ) 1, ' [1 — ехр [ — (А', + Аз) 1~) + лег, (4.44) где й;=я, [АсОй]р]. Если стадия ацилирования протекает в условиях насыщения, то я', = й„, [З]/(К, -]- [Я). В уравнении (4.44) имеется экспоненциальный член, становящийся пренебрежимо малым при 1) 5т, и линейный, дающий в конце концов основной вклад в [НОМр). в. Последовательные обратимые реакции Нахождение общего решения для этого случая мы отложим до разд.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
