Э. Фёршт - Структура и механизм действия ферментов (1128692), страница 44
Текст из файла (страница 44)
9 — тэо(иэ О., Ногсс!гсг В. 1... АгсЬв В1осЬвпс В!орЬув., 179, 977 (19Ю!. З вЂ” Ми!иву й. З., Рсгвм А. й, В!осЬмп!эьу, 19, 997 (!979!. э — ьвт!!эм А„з!эпсир (у. в.. копы«па и. в., зг., В!о«всю!э!гу, ю, эзп (!97В. а — аэубоих Р„Мв!Ьо!гв О. Р.. ВвпгЬвгб 3. А., Сги. йвтв В(осЬею., аы (19791, б — тэ!с 3, 3., Мс(э!вг А., Ргос. пв1п. Асвб. Зс!., ПЗА, 99, 79! (1971!. Г. Количественный анализ кооперативности 1.
Уравнение Хилла; коэффициент Хилла— мера кооперативности 1171 (8.1) Е+ лэ ~ж Еэи. Константа диссоциации имеет следуюший вид; К= (езо) (8.2) Рассмотрим случай полностью кооперативного связывания; молекула фермента имеет л связываюших центров и лиганд присоединяется одновременно ко всем центрам. 983 Степень насыщения у есть л [Е ба! (Е[о (8.3) ! — у = —. [Е[ [Еа[ ' (8.4) Из уравнений (8.2) и (8.4) получаем (и [у/(! — у)! и!8 181 — (Я и. (8.5) Аналогичное уравнение, называемое уравнением Хилла, ! (и [У((! - У)1- л (и[81 — (и К, ( (8.6) удовлетворительно описывает связывание лигандов аллостерическимн белками в интервале от 1О до 90% насыщения. За УУУ Югу у Рнс. 8.7.
График Хилла для свяаывання кислорода с нормальным гемоглобн. ном (рН 7,4). [Кигпагнп Д. Ч., (гпа! К., Лопеа И. Т., !и: Егу(госу(е а(гпс(пге апг( (ппспоп, л!ап й. ь(аа !пс. Нем Уогк, р. 9! (!975),1 пределами этого интервала экспериментальная кривая отклоняется от прямой. Величина (г, определяемая из наклона кривой, коопврлтивнов связывание лнглндов УУ 4 УУ а $ УУ а $ (У ГЛАВА Е описываемой уравнением (8.6), в области полунасыщения (У = = 0,5), известна под названием коэффициент Хилла и является мерой кооперативности. Чем выше и, тем сильнее кооперативность.
В пределе й равен числу центров связывания. Если 6 = 1, то кооперативность отсутствует; при й ) 1 имеет место положительная кооперативность, а при /т ( 1 — отрицательная. Уравнение Хилла можно использовать при кинетических измерениях, если вместо У подставить п: ]я О/(Умак — О) Ь 1И [8] — !К К. 2.
Кривая связывания для модели Моно и др. [4) Пусть константа диссоциации лиганда для комплекса с )[-формой равна Ки, а для комплекса с Т-формой — Кт. Обозначим отношение этих констант через сп с — Ки/Кт. (8.8) ][-состояние с х присоединенными молекулами лигандов обозначим через Й, для Т-состояния введем аналогичное обозначение Т„. В таком случае аллостерическая константа /. определяется выражением Ь [Т1о/[й]ч. (8.9) Доля связанного с лигандом белка У рассчитывается из уравнения материального балланса.
Следует помнить о необходимости введения «статистических множителей» в константы свя. зывания. Например, константа диссоциации' для первой присоединяющейся к гемоглобину молекулы О, равна Кт/4,поскольку число центров, с которыми этот лиганд может связаться, равно четырем, а отщепление осуществляется только от одного центра. Аналогичным образом константа диссоциации для второй присоединяющейся молекулы будет равна 2Кт/3, поскольку имеется три центра, к которым она может присоединиться, но после ее присоединения образуются два центра, от которых молекула кислорода может отщепиться.
Величина У для белка, имеющего п центров, определяется выражением ([й|] + 2 [йт) + ° + и [йл!) + ([Т1] + 2 Тк! + ... + и [Та]) и ([йь) + [й1] + . ° . + !йа) + [Те) + [Т1) + ... + [Тк!) Если перейти к параметрам /. и с и ввести для удобства безразмерную концентрацию субстрата а [8)/Ки. (8.! 1) ' Речь идет о макроскопнческой константе диссоциации (следует ппцнить, что К» и Кт — микроскопические константы диссоциации). — приап рео. коопеРАтиВное сВязыВАние лигАндОВ то уравнение (8.10) преобразуется к виду Его(1+ со)л+1+ н(! + н)л 1 Е (! + со)л+ (! + В)л (8.12) Таблица 8.8 Аллостерические константы для некоторык белков Число центров связы- вания л Козффи- циент Хилла а Источник г ланяыа з) Белок Лиганл 3 ° 10' 2 !03 б) 0,0! ОЩ') Гемоглобин Пируваткнназа (дрожжи) Глнцеральдегнд-3-фосфат- дегидрогеназа (дрожжи) 2,8 2,8 о Фосфоенол- пнруват ЫА1)+ 0,04 з) 1-Ебе(з!е(п 3.
А, Намге, !.»лб., 939, Ме (!9П). 9 — Нас»бе) а., Неаз В., ).а»!егЬ»г» тн„в)ага(ег К.-Н, Норре.беу!ег' ° Е. РЬув!о!. СЬет., 349, 399 09бо: В(*сЬо(Ьегбег Й., Нее* В., доз»ма» Р., (ыб., 339 1139 (199!). 3 — К)гвсЬпег К., Оанебо Е., бсЬ»з!ег 1„0»обан О., Л то)ес, Вго(,. бб, М (197П. б) По оценкам автора. В табл. 8.3 приведен ряд значений Л и с, полученных с помощью ЭВМ путем описания экспериментальных кривых связывания для некоторых белков уравнением (8.!2).
(Это, однако, не означает, что структурные изменения происходят в соответствии с моделью Моно и др.— модель Кошланда и др. предсказывает аналогичную кривую связывания; см. ниже.) а, Зависимость коэффициента Хилла от параметров Ь и с [18] Значение )) можно рассчитать, проанализировав с помощью ЭВМ уравнение (8.12). Установлено, что при постоянном с зави. симость л от Е графически представляется колоколообразной кривой (рис. 8.8), )( =1, когда Е много больше или много меньше с, и принимает максимальное значение, когда Е=с (8.13) Согласно модели Моно и др., ход кривой насыщения для любого олигомерного белка, состоящего из и протомеров, определяется только тремя неизвестными параметрами и концентрацией лиганда [Е, Кн, Кт и [3[, из которых три последние величины связаны с с и (х, а потому входят неявным образом в уравнение (8.! 2) ].
ГЛАВА З (где л — число центров связывания). Подобный характер зависимости й от г'. объясняется тем, что при малых г'. начальная концентрация Й-формы достаточно высока, чтобы обеспечить высокую степень связывания, а при очень большом й концент- рация К-формы слишком мала, чтобы вносить в связывание ощутимый вклад. Рис 8.9. Изменение коэффициента Хилла с изменением параметра Л для сня.
зынаиия кислорода с различнымн мутантнмми формами гемоглобина. (ВаЫ* илп 3, М., Ргои. В!орьуз. Мо!ес. Вю1., 29, 3 (!976).) Колоколообразная кривая представляет особый интерес для анализа эффектов структурных изменений в белке, которые сказываются на величине г'.. Именно на такую кривую ложатся коэффициенты Хилла для широкого круга модифицированных и мутантных форм гемоглобина (рис, 8.9) [19], 6 ф" 2 %, 4 Р У 2 8 Р Г фЛ 4д Е в фг, Рис. 8.8.
Изменение козффидиеита Хилла для тетрамерного белка с изменением параметра 1.. (Ипмп М. М., СЬапкепх З.-Р., д. юо!ес. Вю),, 21, 266 (1966) .) КООПЕРАТИВНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ ЛИГАНДОВ 267 3. Кривая связывания для модели Кошланда и др, В рамках модели Моно и др. выражение для У имеет простой вид благодаря предположению, что имеется только две константы диссоциации, В модели Кошланда и др, каждому промежуточному состоянию соответствует своя константа диссоциации, поэтому простого общего выражения для У не существует.
Число параметров должно быть равно числу центров связывания. 4. Обнаружение кооперативности и сопоставление механизмов Моно и др, и Кошланда и др. Наличие кооперативности выявляется по величине коэффициента Ь, а также по характерным отклонениям от линейности соответствующих анаморфоз кривых насыщения или прямых на г,о у/ГАГ Рнс 6ЛО. График зависимости стекнометрнн связывання т от т/~Ц для про. цесса прнсоедннення лнганда Ь к днмерному белку. графике Скэтчарда (рис.
8ДО). Обнаружение отрицательной кооперативности указывает на невыполнимость простого механизма Моно и др., в то время как положительная кооперативность согласуется с обеими моделями. Анализ формы кривой связывания также не дает однозначного ответа, поскольку обеим моделям соответствуют аналогичные кривые. В принципе различить эти две модели можно, измерив скорость связывания лигандов ~6~. Например, модель Моно и др, дает меньшее число времен релаксации, поскольку включает меньшее число состоя- ГЛАВА З ний. Этот подход был с успехом применен при исследовании глицеральдегид-3-фосфат — дегидрогеназы дрожжей Киршнером и др.
)20], которые показали, что связывание 1чАР~ происходит в соответствии с моделью Моно и др. В то же время исследование связывания лигандов с гемоглобином указывает на существование промежуточных состояний. Выбор модели часто зависит от характера эксперимента. Исследователи, изучающие, скажем, влияние структурных изменений в молекуле гемоглобина на сродство кислорода и коэффициент Хилла, предпочитают пользоваться моделью Моно и др., поскольку она является по своей природе структурной, Эта модель позволяет легко предсказать характер связывания лиганда и интерпретировать экспериментальные данные.
Использование ее для нахождения коэффициента Хилла и анализа результатов исследования равновесных процессов дает очень хорошие результаты. Ученые, занимающиеся кинетическими исследованиями, предпочитают модель Кошланда и др., поскольку кинетические параметры более чувствительны к существованию промежуточных состояний. В теории Кошланда и др. больше параметров и больше возможностей для подгонки. Д.
Молекулярный механизм кооперативного связывания для гемоглобина [3) 1. Физиологическое значение кооперативного связывания кислорода Положительная кооперативность не предназначена для увеличения сродства гемоглобина к кислороду; константа связывания кислорода свободными цепями гемоглобина значительно выше константы связывания первого моля кислорода дезоксигемоглобином и приблизительно равна константе связывания кислорода оксигемоглобином. Положительная кооперативность обеспечивает резкое изменение степени сродства в очень узком диапазоне давлений кислорода. Это позволяет гемоглобину насытиться кислородом в легких и затем высвободить примерно 60% его в тканях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
