Автореферат (1090325), страница 8
Текст из файла (страница 8)
15Б,вставка), что свидетельствовало о более быстрых переходах конформационныхподсостояний в случае мутанта. Этот результат можно объяснить как увеличениемподвижности жестких структурных элементов (N- и С-концевых доменов) относительнодруг друга, так и наличием менее стабильной третичной структуры в целом. В отличие отфермента дикого типа, ширина как короткой, так и длинной компонент распределенияпродолжительности эмиссии мутанта I14K в диапазоне от 10 до 35°С была менееподвержены воздействию температуры (рис.
15В). В условиях, когда температуранаходилась на отметке ниже 40°С, практически никакого эффекта не наблюдалось. Сдругой стороны, при дальнейшем повышении температуры структурная разнородностьувеличивалась, достигая максимума при 55-60°C. Хотя подобная тенденцияпрослеживалась как для фермента дикого типа, так и Y98R мутанта, ширина обеихкомпонент распределения мутанта I14K в диапазоне температур от 10 до 35°Спревышала в 2,5 раза значения ширины соответствующих компонент распределенияфермента дикого типа и в 3-5 раз мутанта Y98R (рис. 15В, вставка).
Эти различияпоказывают, что по сравнению с мутантом Y98R и r12/15-LOX мутант I14K имеет болеежесткую и, возможно, более гидратированную структуру.Таким образом, боковые цепи Тyr98 и Тyr614 могут играть роль якорных групп,участвующих во взаимодействии N-терминального и каталитического доменов r12/15-LOX.Полученные данные свидетельствуют о том, что увеличение подвижности N-концевогодомена по отношению к каталитическому домену за счет потери ароматическоговзаимодействия приводит к структурным изменениям молекулы фермента, которыесвязаны с частичной дестабилизацией его вторичной и третичной структур.4.1.6.
Вклад Arg403 в стабильность структуры r12/15-LOX. Arg403 являетсяякорной детерминантой r12/15-LOX, которая, как предполагают, вступает вовзаимодействие с карбоксильной группой ПНЖК в процессе ферментного связывания.Анализ кристаллической структуры r12/15-LOX, а также моделирование с использованиемметодов молекулярной динамики для фермента дикого типа, не содержащего лиганда,показали, что Arg403 образует водородные мостики с боковой цепью Glu176 (спираль α2),Glu399 и взаимодействует с Lys172. Glu399, в свою очередь, образует в процессемоделирования непостоянные водородные связи с Arg166 (рис.
16А). При потере ионноговзаимодействия (замена Arg403 на Leu) происходит реорганизация в структуре белка (рис.16Б), при которой Glu399 находит нового партнера для образования водородной связи(Lys172). Интересно отметить, что Lys172 находится в начальном сегменте α2 спирали,элементы которого теряют свою α-спиральную структуру в результате конформационногоперехода при связывании с ингибитором (конформер Б, PDB 2Р0М). Кроме того, призамене Arg403 на Leu, водородные мостики между атомом азота амидной группы остатка вположении 403 и карбоксильной группой Glu399 ослабевают, что, как следствие, можетпривести к структурной перестройке участка цепи содержащей остатки Glu399 и Arg403. Посравнению с данными, полученными для фермента дикого типа, исследования33Рис. 16. Результаты моделирования молекулярной динамики для r12/15-LOX (А) имутанта R403L (Б).
(В и Г) Температурная зависимость распределенийпродолжительности эмиссии флуоресценции. Показаны короткие компонентыраспределений продолжительности эмиссии для водного раствора r12/15-LOX (1мкM) в диапазоне температур от 10 до 50°C (В) и для водного раствора мутанта R403L(1 мкM) в диапазоне температур от 10 до 48°C. (Д) Центр масс спектра эмиссиифлюоресценции r12/15-LOX и мутанта R403L как функция давления.
(Е) Кинетикаденатурации r12/15-LOX и мутанта R403L как функция концентрации GdnHCl.Экспериментальные значения представляют собой величины интенсивности сигнала вспектрах флюоресценции и кругового дихроизма при 222 нм. Кривые описываются однимуравнением, предполагая, что кинетика денатурации как вторичной, так и третичнойструктуры белка совпадает.с применением метода динамикой флуоресценции показали существенное изменениешириныраспределениякороткойкомпонентыпродолжительностиэмиссиифлуоресценции мутанта R403L (рис. 16В и 16Г). Если для R403L ширина короткойкомпоненты возрастала в диапазоне температур от 10 до 30°С, отражая повышеннуюразнородность системы, то для фермента дикого типа наблюдался противоположныйэффект.
При температурах выше 40°С, когда оба белка находятся на стадии,предшествующей денатурации, ширина короткой компоненты продолжительностиэмиссии для фермента дикого типа увеличивалась, а для мутанта R403L оставаласьпрактически неизменной (рис. 16В и 16Г). Эти данные позволяют предположить, чтозамена Arg403 на Leu индуцирует повышенную чувствительность третичной структурымутанта к изменениям температуры. Хотя структурные основы наблюдаемых измененийпри температурах ниже 30°С остаются невыясненными, они могут быть изначальносвязаны с повышенной степенью гидратации структурных элементов белка в областимутации.Для проверки данной гипотезы было исследовано изменение флуоресцентныхсвойств r12/15-LOX вследствие мутации R403L как функции давления. Повышениедавления в системе может заставить молекулы растворителя глубже проникать в белок,повышая гидрофильность окружения триптофановых остатков, понижая тем самым34интенсивность эмиссии флуоресценции.
Для фермента дикого типа и мутанта смещениецентра масс (максимума флуоресценции триптофанов) представляет собой кривую сдвумя переходными состояниями и плато (показано стрелками) между двумя регионаминаиболее выраженных изменений, индуцированных повышением давления (рис. 16Д).При низких температурах (20°С) кривые перехода обоих белков практически неотличаются друг от друга, тогда как при 40°С – температуре – которая соответствуетсредней точке перехода вторичной структуры белка (рис.
16В), мутант проявляетнаибольшую конформационную разнородность. Сдвиг плато (рис. 16Д, отмеченострелкой) с величин в 1000-1500 бар (фермент дикого типа) в диапазон более низкогодавления (500-1000 бар; рис. 16Д, стрелка со звездочкой) для мутанта позволяетпредположить, что изменения в третичной структуре мутанта на первой стадии переходатребуют меньше энергии. Эти данные согласуются с изменениями короткой компонентыпродолжительности эмиссии флуоресценции и подтверждают ранее высказанноепредположение о том, что третичная структура мутанта может быть частичнодестабилизирована из-за повышенного воздействия молекул растворителя на егоструктурные элементы. Данная гипотеза подтверждается исследованиями поденатурации r12/15-LOX и ее мутанта под действием GdnHCl.
Так как GdnHCl способенвступать во взаимодействие с пептидными связями, структурные элементы белка,имеющие непосредственный контакт с молекулами растворителя, наиболее подверженывлиянию его воздействия. Кривые денатурации LOX включают два переходных состоянияв области концентраций GdnHCl между 0,7 и 1,5 М, а также 2,0 и 3,0 М GdnHCl, исодержат плато при 1,5-2,0 М GdnHCl. Подобный профиль кривых позволяетпредположить, что денатурация фермента может быть описана с помощью модели,предусматривающей наличие 3-х основных состояний (M↔I↔U), в которой состояние Mнативная конформация белка, I частично денатурированный белок и U полностьюденатурированный белок.
Анализ кривой денатурации (рис. 16Е) позволяет определитьсвободную энергию ΔG1 первого перехода (M↔I) в 11,7±0,6 ккал/моль. Оценочноезначение свободной энергии второго перехода (I↔U) составляет 25% от этой величины(ΔG2=3,2±0,2 ккал/моль). Напротив, для мутанта R403L свободная энергия для первогоперехода ΔG1 составляет лишь 30% (4,6±0,2 ккал/моль) от величины ΔG1, полученной дляфермента дикого типа, тогда как значения свободной энергии второго переходногосостояния не отличаются сильно друг от друга (3,2 ккал/моль для r12/15-LOX и 5,0ккал/моль для мутанта R403L).
Интересно, что для перехода M↔I так называемой miniLOX (изолированного С-концевого домена r12/15-LOX) значение ΔG1 (3,4±0,2 ккал/моль)сопоставимо со значением ΔG1 (4,60±0,2 ккал/моль) для мутанта R403L. Представленныеданные показывают, что как мутанту R403L, так и С-концевому каталитическому доменутребуется меньше энергии для конформационного перехода из их основных состояний Мв промежуточное состояние I. Таким образом, по сравнению с ферментом дикого типа обамодифицированных белка могут изначально присутствовать в более гидратированномсостоянии.
Этот вывод дополнительно подтверждается анализом величин m, которыенаходятся в строгой корреляции с изменением площади поверхности доступнойрастворителю (ΔASA) в процессе денатурации белка (Myers et al. (1995) Protein Sci. V.4.P.2138–2148). Параметры m, рассчитанные по кривым перехода mini-LOX и мутанта35R403L, 2,5±0,1 и 3,3±0,2 ккал/моль М, соответственно, в 3-4 раза ниже значения m,рассчитанного для фермента дикого типа (11,1±0,5 ккал/моль М).4.1.7.
Функциональная роль Arg403 в структуре r12/15-LOX. Замена Arg403 на Leuв r12/15-LOX человека приводит к существенному понижению как каталитическойактивности фермента, так и его сродства к АК и ЛК. Для изучения влияния структурныхизменений, вызванных мутацией, на свойства фермента были выделены фракциимутанта R403L, которые не проявляли признаков неспецифической олигомеризации. Вотличие от фермента дикого типа, который окисляет ЛК и AК по механизму,описываемому уравнением Михаэлиса-Ментена в диапазоне концентраций от 2 до 80мкМ, для мутанта R403L было обнаружено субстратное ингибирование в присутствиинизких концентраций жирных кислот (15-25 мкм). Для количественной оценкикаталитических свойств мутанта R403L был проведен анализ экспериментальных данныхв диапазоне концентраций субстрата, где кинетика ферментативной реакции может бытьв приближении описана уравнением Михаэлиса-Ментена.
Каталитическая эффективность(kcat/Км*) мутанта R403L при окислении ЛК значительно ухудшалась вследствие мутации, вто время как эффективность окисления АК оставалась практически без изменений.Метилирование карбоксильнойТаблица 6. Кинетические параметры окисления ПНЖКгруппы АК, в свою очередь,r12/15-LOX и мутантом R403Lприводило к резкому понижениюr12/15-LOXМутантR403LПНЖКэффективностиокисленияkcat/KM*kcat/KM*KM*KM*модифицированного субстрата(c-1мкM-1)(мкM)(с-1мкM-1)(мкM)мутантом R403L (табл. 6).ЛК2,65±0,2616,9±2,6 0,83±0,09a28,1±7,5Интересноотметить,чтоАК1,41±0,178,2±1,45 1,95±0.33b10,9±3,8использованиеметиловогоMe-AК 0,76±0,2318,6±7,4 0,17±0,03c11,4±3,1эфира арахидоновой кислотыaрасчитано для диапазона концентрации 0-25µM ЛКbрасчитано для диапазона концентрации 0-15µM AК(Ме-АК)такжеиндуцируетcрасчитано для диапазона концентрации 0-50µM Me-AКингибирование мутанта R403L,но только при более высоких концентрациях субстрата (выше 100 мкм).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
