Автореферат (1090325), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Используя метод «твердого тела» былиполучены структуры низкого разрешения (30 Å), которые достаточно хорошо описываютэкспериментальные данные (рис. 20В). В присутствии 10-кратного молярного избытка13(S)-HODE объемная доля димера увеличивалась с ~15 до 95%, предполагая, чтолиганд сдвигает равновесие ферментных фракций из мономерного практическиполностью в сторону димерного состояния.
Как в случае мономера, так и димера, Nконцевой домен отодвигается от каталитической единицы, что приводит к значительномуувеличению радиуса частиц (рис. 20В). Этот результат подтверждает ранее полученныеТаблица 9. Доля мономеров и димеров в водных растворах r12/15-LOX иW181E+H585E мутанта в присутствии лиганда.мутант (W181E+H585E)r12/15-LOXизбытоклиганда(моль)χ*<Rg>(нм)объемнаяфракциямономера(%)объемнаяфракциядимера(%)χ<Rg>(нм)объемнаяфракциямономера(%)объемнаяфракциядимера(%)01,383,3±0,184161,15 3,2±0,18614401,094,5±0,123771,01 3,4±0,17723данные (разд. 2.2.1) о возможности участия аминокислотных остатков междоменногоинтерфейса в процессах субстратного связывания.
При более высоких концентрацияхлиганда (40-кратный избыток) объемная доля димера снижалась до 77% (табл. 9), чтовозможно в условиях образования неустойчивых гомодимерных комплексов Б:Б, когдастатистически более 50% молекул фермента содержат лиганд. Хотя при разрешении в 30Å невозможно определить детально структурные элементы, непосредственнововлеченные во взаимодействие двух молекул, полученные данные однозначнопоказывают изменения, происходящие на поверхности молекулы r12/15-LOX вприсутствии лиганда (13(S)-HODE). При этом 13(S)-HODE выступает в ролимолекулярного триггера, который сдвигает динамическое равновесие в ряду мономер–димер между молекулами r12/15-LOX в водной среде в сторону образования переходногодимерного комплекса.4.2.4.
Исследования интерфейса в димере r12/15-LOX с применением методаМРР и направленного мутагенеза. В кристаллографическом димере r12/15-LOX Leu179,Leu183, Leu188 и Leu192 образуют гидрофобный кластер, в котором каждые два остаткалейцина,отдаленныедруготдруганавитокодной2-спирали,образуютнепосредственный контакт с соответствующей парой антипараллельной 2-спирали41другого мономера (рис. 20Б). Такая организация напоминает мотив лейцинового зиппера,супрамолекулярной структуры, которая функционирует как димеризующий доменпосредством генерации адгезионных сил между индивидуальными мономерами. Также,Trp181 2-спирали взаимодействует с остатком His585 18-спирали, дополнительностабилизируя интерфейс.
В том случае, когда все эти гидрофобные элементы вовлеченыв межмолекулярную ассоциацию r12/15-LOX, индуцированную 13(S)-HODE, введениезаряженных аминокислотных остатков должно дестабилизировать гидрофобныйинтерфейс и препятствовать димеризации. Для поиска наиболее подходящих кандидатовдля точечного мутагенеза каждый из остатков гидрофобного интерфейса был заменен insilico на остатки 19-ти протеиногенных аминокислот. На основе расчетов свободнойэнергии были выбраны две комбинации аминокислот, для которых отталкиваниемономеров показало наилучшие результаты. С использованием методов геннойинженерии были созданы соответствующие двойные мутанты (L183E+L192E иW181E+H585E).В отличие от фермента дикого типа, для которого 13(S)-HODE вызываладимеризацию (рис.
20А), в случае мутанта W181E+H585E эффект лиганда отсутствовал(рис. 21, табл. 9). Для мутантаL183E+L192E в отсутствии 13(S)HODE было получено несколькобольшее значение Rg = 3,6±0,1 нм.Когда белок инкубировали с 13(S)HODE,экспериментальныйпрофилькривоймалоугловогорентгеновского рассеяния выявилзначительные изменения во всемдиапазоне значений s от 0,1 нм-1 до2,5 нм-1 (рис. 21Б). Анализ данныхМРР для L183E+L192E мутанта,связанного с лигандом, позволилопределить величины Rg =4,3±0,1нм и Dмах=13±1 нм. Хотя эти Рис.
21. (А) Экспериментальные данные и модельполученная на основе линейной комбинациизначения аналогичны тем, которые мономера и димера (P2-симметрия) W181E+H585Eполучены для димера фермента (черные точки и линия 1) без лиганда и фермента вприсутствии 40-кратного молярного избытка 13(S)дикого типа в кристалле (4,1 нм), HODE(красныеточкиилиния2).(Б)плато в диапазоне величин s от 0,8 Экспериментальные данные и модель, полученнаядо 1,3 нм-1 предполагает, чтомолекулы мутанта L183E+L192Eобразуют ассоциаты, отличающиесяпоформеимолекулярнойорганизации (рис.
21Б). Ab initoмодельпредполагаетобъем3ассоциата равный 480±10 нм , что в2,5 раза превышает объем димерана основе линейной комбинации мономера итетрамера L183E+L192E в P222 симметрии (черныеточки и линия 1) без лиганда и фермента вприсутствии 40-кратного молярного избытка 13(S)HODE (красные точки и линия. Экспериментальныеданные скорректированы с учетом экспериментальных кривых МРР для буфера, не содержащегофермент, а также буфера, содержащего 13(S)-HODE всоответствующихконцентрациях.(В)моделитетрамера комплекса мутанта L183E +L192E с 13(S)HODE в P222 симметрии.42(2P0M: 190 нм3).
Оценка молекулярной массы приводит к величине в 230±10 кДа,превышающей в 3 раза массу мономера r12/15-LOX (75 кДа). Эти результатысвидетельствуют о том, что фермент находится в олигомерном состоянии в виде тримераили тетрамера. Попытки создать устойчивую модель тримера не имели успеха, в товремя как модель тетрамера, содержащая мономеры r12/15-LOX в качестве субъединиц вP222 симметрии практически идеально (фактор расхождения χ=1,08) описывалаТаблица 10. Доля мономеров и олигомеров в водном растворе мутантаL183E+L192E без лиганда и в его присутствии.мономер-димеризбытоклиганда(моль)040χ*объемнаяфракциямономера(%)мономер-тетрамеробъемнаяфракциядимера(%)χобъемнаяфракциямономера(%)объемнаяфракциятетрамера(%)1,1671291,23919---1,0877100экспериментальные данные (рис.
21Б). Значение Rg, определенное для мутантаL183E+L192E в отсутствие лиганда, превосходило величину Rg фермента дикого типа.Предполагая наличие равновесия в ряду мономер–димер, это несоответствие можнообъяснить как увеличением доли димеров на ~30% (χ=1,16) (табл.
10), с одной стороны,так и присутствием 10% тетрамеров в мономерной фракции (90%) (χ=1,23), с другой. Сучетом предположения, что введение мутаций способствует отталкиванию мономеров,использование димерной модели в данном случае становится мало приемлемым. Болеетого, такая модель не объясняет экспериментальные данные, полученные дляL183E+L192E мутанта в присутствии лиганда. Структурный анализ показывает, что 2спирали в модели тетрамера не имеют контакта (рис. 21В).
Хотя в отличие отW181E+H585E двойной мутант L183E+L192E находится в олигомерном состоянии,полученные данные ясно показывают, что мутации аминокислот Leu183, Leu192, Trp81, His585приводят к дестабилизации структуры интерфейса димера, который присутствует вферменте дикого типа.4.2.5. Изучение устойчивости димеров фермент-субстратного комплексаr12/15-LOX и мутантов с использованием методов молекулярной динамики11. Длявыяснения способности r12/15-LOX образовывать межмолекулярные ассоциаты вприсутствии субстрата (АК), были созданы модели димеров для фермента дикого типа имутантов (W181E+H585E и L183E+L192E), в которых конформер А являлся несодержащей лиганда молекулой, тогда как конформер Б связан с АК в активном центре.Моделирование было проведено в условиях полной сольватации молекул фермента.Несколько свободно перемещающихся катионов натрия были добавлены в систему дляподдержания ее нейтральности.
Анализ траекторий (4 нс) мутанта W181E+H585E показал11Расчетывыполнены группой проф. А. Гозалес-Лафонт в Институте биотехнологии ибиомедицины Автономного университета г. Барселоны, Испания. Участие диссертантазаключалось в формировании гипотезы, постановке задачи и анализе полученных результатов.43Рис.
22. Сопоставление структур интерфейса в димере: (А) димера ферментадикого типа (красный) с димером мутанта W181E+H585E (серый) и (Б) димерафермента дикого типа (красный) с димером мутанта L183E+L192E (желтый). (В)Фрагмент интерфейса в димере W181E+H585E в 4 нс траектории. (Г) Фрагментинтерфейса в димере L183E+L192E в 4 нс траектории.
(Д) Фрагмент интерфейса вдимере фермента дикого типа в 4 нс траектории.раскрытие межмолекулярногоинтерфейса(рис.22А, В)врезультатеэлектростатического отталкивания, сопровождаемого переориентацией боковых цепейGlu585 (конформер А) и Glu181 (конформер Б). Переориентация остатков аминокислот посайтам мутации вызывала проникновение молекул воды и, в конечном итоге, катионовнатрия в межмолекулярное пространство для стабилизации этой области (рис.
22В),приводя к изменениям в гидрофобной части интерфейса (остатки лейцина). В процессемоделирования наблюдалось вращение конформера А относительно конформера B, врезультате чего площадь межмолекулярного интерфейса уменьшалась с 116449 Å2(фермент дикого типа) до 69310 Å2 (рис. 22А). При анализе траектории для мутантаL183E+L192E также наблюдалось уменьшение площади межмолекулярного интерфейсадо 71266 Å2. В этом случае (рис.
22Б) происходили значительные изменения координат2 спирали конформера B, что приводило к уменьшению площади интерфейса. Хотяпараллельное электронное взаимодействие между His585 (мономер А) и Trp181(мономер Б), наблюдающееся в кристаллической структуре, сохранялось некотороевремя, оба остатка принимали новые конформации, в которых их плоскости былиповернуты перпендикулярно друг другу (рис. 22Г). Напротив, в ферменте дикого типа электронное взаимодействие между His585 и Trp181 сохранялось на протяжении всей44траектории и гидрофобные взаимодействия интерфейса оставались стабильным,сохраняя площадь поверхности в 116449 Å2 (рис. 22Д). При этом 2 спираль обладаладостаточной подвижностью, сохраняя при этом совместный интерфейс димера.4.2.6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
